|
-mavzu. Oʻsimlik hujayrasidan DNK ajratish
|
| bet | 54/109 | | Sana | 22.02.2023 | | Hajmi | 3.04 Mb. | | #43169 |
Bog'liq Biotexda bioxavfsizlik majmua 2022 Osimlikshunoslik Документ Microsoft Word, Apakxujayeva. Suv omborlari gidravlikasi, Fizikaning zamonaviy tatqiqot usullari MT, Aholi statistikasi B B Usmonov, A D Abdurahmonov Darslik Toshkent, 3333, 8-dekabr, Документ Microsoft Word17-mavzu. Oʻsimlik hujayrasidan DNK ajratish
Mashgʻulotning maqsadi. Gen muhandisligida genlarni ajratib olish, ularning strukturasini, ekspressiyasini oʻrganishda DNKni toza holda ajratib olish muhim sanaladi.
Kerakli jihoz, reaktiv va asbob uskunalar:4 g 14 kunlik g‘oʻza barglari, xavoncha, sentrifuga, sentrifuga stakanlari, 2 ta kolba, 2 ta stakan, shisha tayoqcha, refraktometr, dializ qog‘ozi, magnitli aralashtirgich, spektrofotometr va muzlatgich.
Oʻsimlik hujayrasidan DNK ajratish boʻyicha
Uslubiy koʻrsatma
Rekombinant DNKlar texnologiyasiga asoslangan gen muhandisligi tajribalarida ajratilgan DNK genom klonlarining bankini yaratishda, foydali genlarni aniqlashda, genom bankidagi klonlardan shu genlarni topish uchun zarurdir.
Gen muhandisligida genlarni ajratib olish, ularning strukturasini, ekspressiyasini oʻrganishda DNKni toza holda ajratib olish muhim ahamiyatga ega. Prokariot va eukariot organizmlar DNKsi hujayraning boshqa moddiy qismlaridan ajratilgandan soʻng ular orasidagi moddiy farq yoʻqoladi.
Oʻsimlik hujayrasidan DNK ni ajratish quyidagi bosqichlarni oʻz ichiga oladi.
1-bosqich. Hujayra toʻqimalarini maydalash, hujayra devorini parchalash (gomogenizatsiya), odatda suyuq azot yoki quruq muz yordamida amalga oshiriladi.
2-bosqich. Hujayra qobig‘ini parchalab, DNKning ekstraksiya buferiga chiqishi, bunda detirmenantlardan foydalaniladi. Detergentlar sifatida dodesilsulfat natriy (SDS), setiltrimetilammoniybromid (STAB)dan foydalaniladi. DNKni gidrolizlovchi fermentlar – nukleazalardan himoya qilish uchun EDTA (etilendiamintetrasirka kislata) qoʻllaniladi.
3-bosqich. DNKni oqsillardan tozalash (deproteinezatsiya) xloroform va fenol yordamida ekstraksiya qilish orqali amalga oshiriladi. DNKni choʻktirishda etanoldan foydalaniladi.
Gen muhandisligining poydevori-rekombinant DNK lar texnologiyasi genetik struturalarini birga qo‘shish texnikasi molekulyar biologiyaning eng muhim yutuqlaridandir. Bu texnologiyadan foydalanib zarur mahsulotni (oqsilni) kodlaydigan DNK molekulasining kichik bir qismi genni kesib olish, uning yot gen bilan kombinatsiyasini yaratish, so‘ngra bu yangi genomni munosib hujayralarga kiritib xo‘jayin hujayra DNKsining sintez mexanizmi yordamida ko‘p martalab ko‘paytirish mumkin. Sun’iy sharoitda rekombinant DNK olish va genlarni klonlash ilk bor 1972-yilda AQSh olimlari Boyer va Koen tomonidan amalga oshirilgan. Bu olimlar E.soli bakteriyasining xromosoma DNKsiga va shu bakteriya plazmidasiga alohida idishlarda EsoRI restriktaza fermenti bilan ishlov berganlar. Plazmida tarkibida faqat 1 dona EsoRI restriktaza fermenti tanib kesadigan maxsus nukleotidlar izchilligi bo‘lganligi sababli ferment plazmidaning halqasimon DNK qo‘sh zanjirini faqat bir joyidan kesib, plazmidani "yopishqoq" uchli ochiq holatga o‘tkazadi. Xromosoma DNK molekulasida EsoRI restriktaza fermenti taniy oladigan maxsus nukleotidlar izchilligi qanday bo‘lsa, bu molekula shuncha bo‘lakka bo‘linadi. Turli xil o‘lchamga ega bo‘lgan DNK molekulasi elektroforez uslubi yordamida ajratib olinadi. Ajratib olingan "yopishqoq" uchli xromosoma DNKsi bo‘lagi ochiq holatdagi "yopishqoq" uchlik plazmida DNK si bilan aralashtirilib ligaza fermenti yordamida tiklanadi. Natijada plazmida tarkibiga xromosoma DNK bo‘lagi kiritiladi.Shu boisdan rekombinant DNK ga quyidagicha ta’rif berish mumkin: har qanday tirik organizm irsiy molekulasining istalgan bo‘lagini vektor molekulalariga birikishidan hosil bo‘lgan sun’iy DNK rekombinant DNK deyiladi. Rekombinant DNK olishda uchta- konnektor, restriktaza ligaza va linker molekulalari usullaridan foydalaniladn. Konnektor usulida rekombinatsiyada ishtirok etuvchi DNK bo‘dagining 3' uchiga dezoksinukleotidiltransferaza fermenti yordamida ma’lum uzunlikdagi oligo (dA) - segmenti ulanadi. Ikkinchi uchiga esa oligo ((dT) - segmenti ulanadi. Bu DNK bo‘laklari aralashtirilganida dA va dT setmentlarning vodorod bog‘lari asosida komplementar birikishi tufayli halqasimon DNK strukturasi hosil bo‘ladi. Hosil bo‘lgan DNK dagi bir zanjirli bo‘sh joylar DNK-polimeraza fermenti yordamida to‘ldiriladi.
Restriktaza-ligaza usuli eng sodda va oson rekombinant DNK olish usuli hisoblanadi. Bu usulda DNK molekulasi va vektor plazmida "yopishqoq" uchlar hosil kiluvchi restriktaza bilan qirqiladi va aralashtirilgan holda ma’lum sharoitda reassotsiatsiya qilinadi. Komplementarlik xususiyatiga ko‘ra DNK molekulalari o‘zaro vodorod bog‘lari yordamida birikib halqasimon struktura hosil qiladi va DNK zanjirining birikmagan joylari DNK-ligaza fermenti yordamida ulanadi.
Linker molekulalaridan foydalanish usulida DNK molekulasiga va vektor plazmidaga T4 fag DNK-ligaza fermenti yordamida maxsus nukleotid ketma-ketligiga ega bo‘lgan linker molekula ulanadi. Olingan ikki turdagi DNK molekulasi restriktaza fermenti yordamida qirqilib aralashtirilgan holda reassotsiatsiya qilinadi. DNK va vektor plazmida molekulalarining birikmagan joylari DNK-ligaza fermenti yordamida ulanadi. Shu yo‘sinda rekombinant DNK molekulasi hosil bo‘ladi.
|
| |
