Genomika fanining metodologiyasi
Molekulyar biologiya fanining ilmiy-izlanishi aksariyat tarjriba-eksperiment asosida olib
borilganligi uchun unda qo‘llaniladigan asosiy uslubiyot fizikaviy-kimyoviy o‘lchamlar asosida
amalga oshadi. Mazkur sohada ko‘proq molekulyar tilga olinganligi sababli avvallambor fanda
qabul qilingan molekulalarning o‘lchamlari(uzunligi, hajmlari, molekulyar massalari) haqida
ayrim ma’lumotlarni eslatamiz. Atomlarning o‘lchami 10
-10
metr(m) teng bo‘lib, bir
millimetrning o‘n millionidan bir ulushga barobar, yoki 0.1 nanometr(nm) deb ham belgilanadi.
Masalan S-S o‘rtasidagi kimyoviy bo‘g‘ning masofasi 1.54 A
o
ga teng. Biomolekulalardan
qandlar yoki aminokislotalar o‘lchami yuqorida ko‘rsatgichdan bir necha barobar ortiq.
Molekulalardan oqsillar esa bir necha o‘n marta o‘lchami ortiq ekanligi aniqlangan.
Eritrotsitlardagi kislorod tashuvchi oqsil-gemoglabinning diametri 65A
0
. Viruslarning o‘lchami
100A
0
(10nm) dan 1000A
0
(100nm) gacha atrofida bo‘ladi. Hujayralapning o‘lchami
molekulalarga nisbatan bir necha barobar ko‘p bo‘lib mikrometrlarda (bir mikron bir
millimetrning mingdan biriga teng). Masalan, eritrotsitlarning eng uzun o‘lchami 7
mikrometr(mkm) yoki 7*10
4
ga teng. Biologik strukturalarning aksariyat qismi 1A
0
(0,1nm) dan
to 10
4
A
o
(1mkm) atrofida kuzatilgan.
2000 yili Britaniyalik olim Djon Salston va Amerikalik olim Kreygu Venterlar tomonidan
birinchi bo‘lib odam genomining xaritasi yaratildi. Odamning genetik kodi 3,1 milliard ma’lum
izchillikdan joylashgan nukleotiddan ibort bo‘lib, ular odam DNK molekulasini hosil qiladi,
genetik kod DNKda nukleotid shaklida yozilgan. YUqorida qayd etilgan olimlar «Odam
genomida» qaysi genlar inson hayotiga qanday ta’sir ko‘rsatishini, ya’ni uning sochining
rangidan to yurak-qon tomir yoki rak kasalliklariga olib kelish mumkinligini aniqlashga
kirishdilar.
Tirik
organizmning
tarkibidagi
molekulalarni
fermentlar
yordamida
muayyan
mahsulotlarga ma’lum muddat ichida aylantirib turadi. Fermentlar substratni mahsulotga
parchalash yoki sintezlash vaqti millisekundlar (ms, 10
-9
s-0,001 sek) orasida sodir bo‘ladi.
Ayrim fermentlarning ish vaqti yanada tez bo‘lib, reaksiya tezligi mikrosekund(mks, 10
-6
s)
ichida amalga oshadi. Makromolekulalarning konfarmatsion o‘zgarishi ham juda tez vaqt ichida
sodir bo‘ladi. Misol uchun, DNK molekulasining replikatsisi va ekspressiyasi uchun, ikkilamchi
69
strukturani ikkiga ajralish vaqti mikrosekundlarda sodir bo‘ladi. Oqsillardagi bir domenni
ikkinchisiga nisbatan o‘z holatini o‘zgartirish uchun nonosekund (ns, 10
-9
s) ichida bo‘ladi.
Makromolekulalardagi nokovalent bog‘larning hosil bo‘lishi yoki uzilishi uchun nonosekund
kerak bo‘ladi. Bundanda tez sodir bo‘ladigan jarayonlar lazer qurilmalarda qisqa yorug‘lik
impul’slarini keltirsh mumkin. YOrug‘likning fotonlar tariqasida ko‘z orqali qabul qilinib,
undagi yuz beradigan fizikaviy-kimyoviy jarayonlar va nerv orqali uzatilish vaqti pikosekund
ichida yuz beradi(ps, 10
-12
s). Demak biologik jarayonlarning organizmda sodir bo‘lish
muddatlari har xil vaqtlar ichida sodir bo‘ladi. Biologik tizimlarda sodir bo‘ladigan reaksiyalar
qo‘ydagi chizmada ko‘rsatish mumkin. (vaqt sekundlarda belgilangan)
Mikroskop yordamida biologiya fanida inqilobiy o‘zgarish bo‘lib o‘tgan. Tirik organizm
hujayralardan tashkil topganligi va uning tarkibida organoidlar borligi, Mokrobiologiya va
virusologiya fanlarining shakllanishi mikroskopning kashf qilinishi bilan boshlanadi. Mazkur
asbobning taraqqiyoti oddiy mikroskopdan keyinchalik (1930) interferinsion so‘ng (1932)
fazoviy-kontrast va ohiri (1939) elektron mikroskoplarning dunyoga kelishi bilan harakterlanadi.
Elektron mikroskopda elektronlar oqimiga uchragan atom va molekulalar bilan to‘qnashib
o‘z yo‘lidan og‘ishmasligi uchun, vakuum bo‘lishi kerak, elektronlar yoki magnit maydonlarni
yordamida kuzatish ob’ektiga qarab o‘zgartirish mumkin. Elektron mikroskopda yorug‘lik
mikroskopiga o‘xshash ikki nuqta orasidagi masofani kattalashtiradigan linzalar-ob’ektiv,
okulyar, nurlarni yig‘uvchi kondensor bor, mazkur mikroskopda yorug‘lik linzalari o‘rniga
magnit linzalar qo‘llanadi. Ular yordamida tezlashtirilgan elektronlar oqim kondensor orqali
to‘qima yoki hujayraning maxsus tayyorlangan yupqa kesmasiga to‘g‘irlanib-fokuslanadi.
Elektron mikroskopda qso‘llanadigan elektronlar oqimining to‘lqin uzunligi juda qisqa
bo‘ladi, hozirgi kunda uning ko‘rish quvvati 2A
0
(0,0002 mkm) teng. Elektron mikroskopning
kattalashtira olishi optik mikroskoplarnikidan bir necha barobar yuqori . SHu sababdan elektron
mikroskop yordamida virus, bakteriyalarning strukturasi, hujayra organoidlari nukleoproteyn
komplekslari(xromatin,
ribasomalar
,
gen
xromasomalari)
va
alohida
oqsillarning
makromolekulalari o‘rganilgan. Mazkur uslubiyotning yangi yo‘nalishlaridan-krioelektron
mikroskop yordkamida ribasomalarning nozik strukturalari tadqiq qilinmoqda.
Hujayra strukturasini uch o‘lchamli tasvirini olishda skanirlovchi elektron mikroskoplar
ilmiy tadqiqot izlanishlarda tadbiq qilinishi hozirgi kunda juda ommalashgan.
Molekulyar biologiya fanida keng qo‘llaniladigan fizikaviy asboblardan biri
rentgenostruktur analiz hisoblanadi. Izotoplar (yunoncha), bir kimyoviy elementning har xil,
atom massasi bilan farq qiladi. Izotoplarning atomlari yadrodagi neytronlar soni har xil protonlar
soni bir xil bo‘ladi va elementlar davriy sistemasida bir o‘rinda turadi. Izotoplar barqaror (stabil)
va barqaror bo‘lmaganlari mavjud. Biror makromolekula orqali rentgen nurlari (elektromagnit
nurlanishning to‘lqin uzunligi 10
-10
m) o‘tganda ularni bir qismi atomlar atrofidagi elektronlar
70
tomonidan qaytariladi(diffraksiya) va ekranga yoki rentgen plyonkaga tushib molekula kristallini
difraktogrammasini beradi. Bu suratda minglab turli tig‘izlikda nuqtali chiziqlar(reflekslar)
ko‘riladi, ularni elektron hisoblash mashinalarida maxsus rejalar bo‘yicha hsoblanib olingan
informatsiya asosida molekulaning fazodagi uch o‘lchamli tasviri chiziladi.
Aynan shu usul orqali oqsillar, DNK va RNK larning asosiy strukturaviy ma’lumotlari
olingan. Hozirgi kunda rentgen struktura analizi kamp’yuter texnologiyasi bilan birgalikda
biomolekulalarning uch o‘lchamli fazoviy strukturali tadqiqot qilinmoqda.
Molekulyar biologiya fanining metodologiyasida radioaktiv izotoplar ham etakchi o‘rinlarni
egallaydi. Ushbu islubiyot orqali nuklein kislotalar, oqsillar, uglevodalr va bo‘lak
makromolekulalarning kimyoviy struksturasi va almashinuvi avval ham o‘rganilgan va
o‘rganilmoqda. Radioizotoplar stabil’ atom bo‘lmay balki. o‘z-o‘zidan yadrosi parchalanib
zaryadlangan zarrachalar, elektronlar yoki gamma-nurlanishlar paydo bo‘ladi. Ularning
muddatdan uzoq yillargacha davom etadi. Masalan fosfor R
32
(14 sutka) uglerod atomi esa S
14
5570 yilga to‘g‘ri keladi. Elektronlarni aniqlash ssinsillsion yoki Geyger hisoblagich
moslamalarida gazlarning ionlanishi bo‘yicha yoki radioavtografiya (sezgir fotoemul’sion
qtlamlardagi kumushga ta’siri asosida) orqali aniqlanadi.
Radiofaol
molekulalar
har
xil
kimyoviy
jarayonlarda:
modda
almashinuvida,
metobolitlardan
molekulalarning
sintezida,
hujayralarda
moddaldarning
joylanishini,
funksiyalari va vazifalari aniqlanishi mumkin. Agar hujayrani RNK uchun zarur bo‘lgan
nishonlangan nuleozid orqali inkubatsiya qilinsa RNK ning yadroda sintezlanishi so‘ng
sitoplazmaga kuchirilishini kuzatish mumkin. O‘rganilayotgan molekulaga radioaktivlikni
ferment orqali ham kirgizish mumkin. Masalan fosfotransferaza va nukleotidiltransferazalar
orqali nishonlangan atomlarni oqsil, uglevod va nuklein kislotalarga yuborish mumkin. Mazkur
jarayonlarda har xil shakllardagi radioaktiv ATF lar (ATF S
14
, ATF-2,8 N3, ATF-R32)
foydalaniladi.
Modda almashinuvida molekulalarning sedimentatsiya analizi va ularning massalarini
aniqlashda ul’tratsentrifugirlash molekulyar biologiyada keng qo‘llaniladi. Mazkurmetod 1926
yil shved olimi Svedberg tomonoidan kashf qilingan.
Ul’tratsentrifugalarning aylanish tezligi bir minutda 75000 ga etadi. Bu qiymatni markazdan
qochish kuchiga solishtirsak alanayotgan molekulaning erga tortish kuchi (d) 400 000 ga teng
bo‘ladi. Mana shunday katta kuch ta’sirida molekula yoki zarrachani chukishi sedimentatsiya
deyiladi. Hujayra kompanentlarini, zarracha yoki molekulalarni ul’tratsentrifugalashda cho‘kishi
tezligi sedimentatsiya koeffitsenti deb atalib, S harfi bilan yoziladi. 1S juda kichik o‘lcham
bo‘lib u vaqt o‘lchovidan (sekunlarda) belgilanadi, ya’ni 1*10
-13
s ga teng. Unga to‘g‘ri
keladigan markazdan qochish kuchi dx/dt*1/w
2
x bo‘lib, bunda w-rator aylanio‘ining burchak
tezligi va x-rotor markazidan eritma solingan probirkaning o‘rtasigacha bo‘lagn masofa.
71
Gemoglabin molekulasining sedimentatsiya koeffitsenti 4.5S, T-RNK molekulasi-4S,
lizosomaniki esa 9400S ga teng. Tekshirilayotgan molekula, subhujayra kompanenti qancha zich
va og‘ir bo‘lsa, uning sudimentatsiya koeffitsenti ham shuncha katta bo‘ladi.
Har xil zichlikdagi xlorli seziya ishtirokida ul’tratsentrifugirlash uslubi yordamida DNK ning
polukonservativ
yo‘li orqali replikatsiyasi aniqlangan. Ul’tratsentrifugirlash orqali
makrlmolekulalar, hujayra organoidlarini ajratish , molekulyar massalari va sedimentatsiya
koeffitsentlarianiqlanadi.
Xromatografiya usul eritmadagi modda molekulalarini ikkita: biri harakatsiz (turg‘un),
ikkinchisi shu statsionar qavat orqali fil’tirlanib o‘tadigan harakatchan oqim (elyuent) shaklidagi
fazalar bo‘yicha bo‘linish asosida ajratadigan fizikaviy-kimyoviy sulga aytiladi. Bu usul 1906 yil
rus olimi M.Svet tomonidan kashf etilgan. U birinchi bo‘lib turli birikmalarni adsorbilovchi
material bo‘r kukuni to‘ldirilgan ustun (kolonka) da turlicha yutilishi asosida xlorofill va boshqa
o‘simlik pigmentlarini ajratishga muvfffaq bo‘lgan. Tekshirilayotgan moddalr kolonkada rangli
halqalar shaklida ajralganidan Svet bu usulni xromatografiya (yunoncha xroma-bo‘yoq, grafo-
yozaman) deb atagan.
Hozirgi kunda xromatografiyaning birinchi variantlari mavjud bo‘lib, imolekula yoki
makromolekulalarning zaryadiga qarab matrikslarning har xil turlari ishlatiladi, ularni
ionalmashinuvchi xromatografiya molekulalarining o‘lchamiga asoslangan gel’-xromatografiya
yoki gel’-fil’tratsiya deb ataluvchi xillari mavjud. Xromatografiya usullari ichida samaradorligi
yuqori bo‘lgan asffin xromatografiya (tekshirilayotgan modda yoki molekulaning turg‘un
tutuvchi-ligandlar bilan o‘zaro munosabatlariga asoslangan) hisoblanadi. Misol uchun,
bog‘langan ferment*substrat kompleksini maxsus ligandalr olingan kolonka orqali o‘tkazilsa
ferment ligand bilan bog‘lanib, bo‘lak ballast modda yuvilib ligandda faqat kimyoviy bog‘lanib
qolshan gomogen ferment-oqsilni elyuirlash mumkin. Aynan shu uchsul orqali maxsus
antitelalarni xromasomadagi DNK bo‘lakchalariga bog‘lab toza holda ajratish mumkin. Hozirgi
kunda keng qo‘llaniladigan usllardan yana biri suyuqlik(jidkosnaya). Xromatografiya
hisoblanadi. Xromatografiya kolonkasi kremniyorganik tabiatli smola solinib, muxit gomogen
mikroster bo‘lib ular bosim ostida analiz qilinuvchi molekulalar tez va toza holda fraksiyalarga
ajraladi.
Molekulyar biologiyada qo‘llaniladigan fizikaviy usullardan yana biri elektroforez
hisoblanadi. Elektroforez usullari bilan oqsillarni ajratish, oqsil zarrachalarining elektr
maydondagi harakatchanligini belgilashga asoslangan. Oqsillar molekulasida ko‘p-NH
+
3
SOO
-
guruhlar mavjud bo‘lganidan ular manfiy va musbat zarrachalar, bo‘lib elektr maydonida siljishi
tezligi molekulaning zaryadiga, shakli va o‘lchamiga bog‘liq. Elektroforezni suvli (buferli)
muhitda g‘ovakli polimer tutuvchi : kraxmalli, agarli yoki poliakrilamid gelida sellyulozali va
introtsellyulozali plastinkalarda olib boriladi. Odam gemoglabinini tripsin oqsili bilan
72
parchalangan fragmentlarni sellyulozali plastinkalarda elektroforez qilinib peptidli xaritalar-
“fingerprintlar” (barmoq izlari) tuzilgan. Xuddi shu usul asosida yarimo‘roqsimon anemiya
kasalligi gemoglabinning ß-zanjirida bitta aminokislotaning o‘rni almashib qolganligi
aniqlangan.
Keyingi yillarda oqsillarni poliakrilamid geli (PAAG) da elektroforez olib borish uchun
keng qo‘llanilmoqda . Bu usulda oqsillarni tekshirish uchun bufer bilan xullangan lenta
ko‘rinishidagi fil’tr qog‘oziga yoki gel’ chetiga nuqta yoki chiziq holida bir nechta tomchi oqsil
eritmasi tomizilib, qog‘ozning uchlari eletrogdlar o‘rnatilagan bufer ertmaga botirib qo‘yiladi.
Elektrodlar oqsilli turg‘un elektr oqimi yuborilganda paydo bo‘lgan elektr maydonini kuchi
ta’sirida tomizilgan oqsillar zaryadining miqdori va belgisiga qarab anod yoki katod tomonga bir
necha santimetr siljiydi. Bufer bilan namlangan fil’tor qog‘ozida yoki gellarda shunday
elektroforetik muhit paydo bo‘ladiki, ularda oqillarning zaryadi hamda molekulalarning hajmi
bo‘yicha harakat qiladi, jumladan, gellar molekulyar elektr sifatida ham xizmat qiladi.
Elektroforetik usulda qatoriga izotaxoforez va izoelektrofokusirlash ham taalluqlidir.
Izotaxoforezda ionlar avval o‘zlarining zaryadlari va harakatchanliklariga qarab taqsimlanadi.
Izoelektrofokusirlash usuli oqsillarni bir vaqtda kuchlanish gradientida hamda rN ga qarab
ajratish imkonini beradi.
Hujayrani alohida o‘stirish usuli ham biologiyada jumladan, molekulyar biologiyada keng
qo‘llanilmoqda. Ushbu uslub 1885 yildan boshlangan bo‘lib,tovuq embrionining hujayralari tuzli
eritmalarda uzoq muddat davomida tirik holatda aniqlangan. 1907 yildan esa to‘qimalarning
ma’lum qismlarini ilmiy- tadqiqot ishlarida foydalana boshlagan. Hozirgi kunda dissotsiirlanib
o‘stirilgan hujayradan ko‘p miqdorda bir xil hujayralarni ko‘paytirish mumkin. Ba’zi paytlarda
o‘stirilayotgan hujayraladan mutantlari ham paydo bo‘lib, ular to‘xtovsiz ko‘payish xususiyatiga
ega bo‘ladilar. Ular rak hujayralriga o‘xshash to‘xtovsiz bo‘linishga, ulr yana bir predmedning
ustida yaxshi o‘sish xususiyatiga ega. Bir xildagi o‘stirilgan hujayralarini uzoq muddatga-70
0
S
saqlanib, bu davrda ular proliferatsiya (YAngitdan bo‘lishi, ko‘payish) xususiyatlarini
yo‘qotmaydilar. Kalamushlar va olmaxonlarning (xomyak kemiruvchi hayvon) fibroblastli va
odamning epiteial hujayralari laboratoriya sharoitida ko‘paytirilib ilmiy ishlarda foydalanadi.
Bir xil hujayralarni laboratoriya sharoitida o‘stirishda klonlash usulidan ham keng
foydalaniladi. Boshlanishi bitta hujayradan bo‘linib ko‘paygan hujayralarning populyasiyasiga
klon deyiladi. Klonlash yo‘li orqali mutatsiyaga uchragan muayyan genlarning hujayralari ayrim
oqsillar uchun defektli bo‘ladi. Aynan shu uslub asosda oqsillarning normal hujayralardagi rolini
aniqlash mumkin.
Ikki xil hujayraning qo‘shilishidan ikki yadroli geterokarion hujayrani olish mumkin.
Mitotik bo‘linishidan so‘ng geterokarion gibrid hujayraga aylanib, hamma xromasomalar
yadroga birlashadi. Bunday gibridli hujayralar orqali xromasomalarning alohida funksiyalari,
73
hujayra tarkibidagi organoidlarning o‘zaro ta’sirlarini, normal hujayra bilan qiyosiy ravishda
tadqiqot ishlari olib boriladi. Ma’lumki gibridli hujayralar turg‘un bo‘lmaydi. Jumladan, gibridli
hujayra odam-sichqon ma’lum vaqtdan keyin insoniy xromasomaning faoliyati yo‘qoladi shu
asosda xromasomalarning ayrim funksiyalarini aniqlanib, aynan shu metodologiya genetik
xaritalarni tuzish imkonini beradi.
Molekulyar jarayonlarni o‘rganishda hujayrasiz tizimlar (sistemalar) alohida o‘rin
egallaydi. Bu tizim qo‘shimcha reaksiyalardan holi bo‘ladi. O‘tgan asrning o‘rtalarida (1954) P.
Zamechnik oqsil sintezining translyasiyasida hujayrasiz sistemadan birnchi bo‘lib foydalangan.
Oqsil sintezining transkripsiya, translyasiya jarayonlarining ayrim detallarini o‘rganishda rus
olimi akademik A.S.Spirin samarali foydalangan. Hujayra ekstraktidan oqsil sintezlochi
komponentlarni (i-RNK, ribosomalar,t-RNK va bshqalar) ajratib, so‘ngra ularni alohida-alohida
sistemaga kirgizib funksiyalarini oldinma-ketin aniqlaganlar. Hujayrasiz sistema tufayli genetik
kod dunyoga ma’lum bo‘ldi. Bujarayonda i-RNK o‘rnida tarkibi ma’lum bo‘lgan sintetik oligo
va polenukleotidlar foydalanilgan. Hujayrasiz sistema tufayli DNK-ning replikatsiya va
transkripsiyasi, RNK ning splaysingi fanga ma’lm bo‘ldi.
Molekulyar biolgiyada hozirgi kunda keng qo‘llanilayotgan uslublardan yana biri
monoklonal’ natitela (antitana) bo‘lib, ular murakkab eritmalari molekulalarni aniqlashda
(identifikatsiya qilishda) nozik va sezgir biokimyoviy metodologiya hisoblanadi. Umuman
olganda antitanalar umurtqali hayvonlarda begona birikmalarga qarshi kurashadigan oqsillar
(immunoglobulinlar). Umurtqali hayvonlarning hujayralari har xil shakllardagi ko‘p miqdordagi
antitanalar ishlab chiqarishga qodir bo‘lib, ular o‘ta saralanib har qanday molekulalarni izlab
topish, unga ta’sir qilish xususiyatiga ega. 1976 yilda ß-limfotsitlarni klonlash orqali faqat
maxsus bir xildagi antitanalarni ko‘p miqdorda sintezlash usuli ishlab chiqilgan. Lekin ß-
limfotsitlarning hayotchanligi uzoq bo‘lmaganligi uchun bunday hujayralani tez bo‘linib,
ko‘payadigan rakli hujayralarga qo‘shilib, bunday hujayralani gibridomalar deyiladi. Ulardan esa
keyinchalik monoklonal antitanalar olingan. Monoklonal’ antitanalarda absalyut, maxsus
spetsifik oqsillarga ta’sir qilishi bilan harakterlanadi. Kelgusida monoklonal’ antitanalar tufayli
yangi guruhlar katalitik faol molekulalar abzimlarni sintezlash mumkin.
|