4 pav. AcH koncentracijos priklausomybė nuo laiko prie skirtingų pradinių etanolio koncentracijų.
Duomenys, gauti prie tam tikros koncentracijos, ir atitinkamas modelis pavaizduoti vienoda spalva.
Fig. 4. AcH concentration dependence of time by various initial ethanol concentrations. Experimental data, obtained from exact concentration and appropriate mathematical model are shown in same colour.
Kaip ir šarminės fosfatazės atveju, modeliai priartinami prie duomenų mažiausių kvadratinių nuokrypių metodu.
Henri modelio pritaikymas. Kai gaunamos reakcijos produkto kaupimosi greičio reikšmės prie tam tikrų pradinių substrato koncentracijų, toliau darbo eiga tiek negrįžtamos, tiek grįžtamos katalizės atveju išlieka tokia pati.
Kiekvieno fermento atveju atliekami du vienas nuo kito nepriklausomi bandymai identiškomis sąlygomis. Į vieną grafiką sudedamos visos greičių reikšmės (prie kiekvienos substrato koncentracijos – dvi reakcijos kaupimosi greičio reikšmės). Tada prie duomenų mažiausių kvadratinių nuokrypių metodu priartinamas Henri hiperbolinis modelis (Bumelienė et al. 2005):
(6)
Priartintas modelis (5 pav.) savo parametrais parodo, koks yra maksimalus reakcijos produkto kaupimosi greitis (Vmax), bei kokia yra fermento ir substrato komplekso disociacijos konstanta (ξ = KM). Modelį galima laikyti atspindinčiu gautus duomenis, kadangi jam patikrinti naudojamas Fišerio kriterijus. Abiejų fermentų atvejų yra skaičiuojama FDIST (F;ν1; ν2). ν1 ir ν2 yra lygūs 11 ir 12. Jei FDIST yra mažesnis nei 0,05, tada teigti, kad matematinis modelis neatspindi eksperimento duomenų teigti pagrindo nėra. Šis parametras abiem atvejais yra apytiksliai lygus 0,439, tad modelis yra tinkamas.
5 pav. Produkto kaupimosi greičio priklausomybė nuo etanolio pradinės koncentracijos kartu su priartintu Henri modeliu (mėlyna kreivė). Abscisių ašies mastelis yra logaritmuotas.
Fig. 5. Product growth velocity dependence of initial ethanol concentrations with zoomed Henri model (blue curve). The scale of absciss axis is logarithmed.
Apskaičiuoti kiekvieno fermento parametrai pavaizduoti 1 lentelėje. Katalitinė konstanta apskaičiuojama padalinant maksimalų produkto kaupimosi greitį iš fermento koncentracijos.
1 lentelė. Gauti fermentų parametrai.
Table 1. Obtained enzyme parameters.
Fermentas
|
Vmax, mM/s
|
KM, mM
|
kcat, s-1
|
ALP
|
0,000129
|
4,27
|
304
|
ADH
|
0,00104
|
28,7
|
7790
|
Rezultatų patikrinimas. Modelių, taigi ir juos sudarančių parametrų tikrumas duomenų atžilgiu buvo įrodytas Fišerio kriterijumi. Tačiau vienas svarbiausių dalykų, kurį matematinis modelis leidžia prognozuoti žinant fermento parametrus yra momentinis mišinio medžiagų kiekybinis pasiskirstymas bet kuriuo laiko momentu kai yra žinomi pradiniai medžiagų kiekiai. Tam reikalui abiejų fermentų atveju reakcijų prie dviejų skirtingų substrato koncentracijų duomenys buvo matuojami praėjus 30 min nuo proceso pradžios. Tada atitinkamai buvo apskaičiuojama produkto koncentracija, kurią prognozuoja modelis. Jei reikšmės panašios, galima teigti, kad modelis tikrai atspindi situaciją. Gauti rezultatai aprašyti 2 lentelėje.
2 lentelė. Gautų parametrų patikrinimas.
Table 2. Verification of obtained parameters.
ALP
|
ADH
|
[S] = 0,111 mM
|
[S] = 0,444 mM
|
[S] = 2 mM
|
[S] = 15 mM
|
Exp.
|
Mod.
|
Exp.
|
Mod.
|
Exp.
|
Mod.
|
Exp.
|
Mod.
|
0,024
|
0,023
|
0,0377
|
0,0376
|
0,010
|
0,009
|
0,045
|
0,045
|
Eksperimentiškai gautos reikšmės beveik nesiskiria nuo modelio prognozuojamų reikšmių, tad patikrinimas tik įrodė, kad modelis, taigi ir parametrai, atspindi fermentų veikimą šiose sąlygose.
Apibendrinimas
1. Fermentinių reakcijų duomenys surinkti eksperimentiškai, o jų analizei taikytas matematinis modeliavimas. Minimizuojant kvadratinių nuokrypių sumas prie eksperimento duomenų priartinti kinetiniai modeliai ir nustatyti reakcijos greičiai prie skirtingų substrato koncentracijų. Pagrindiniai fermentą apibūdinantys parametrai įvertinti pasitelkiant Henri modelį, kuris priartintas prie greičio reikšmių. Atlikta patikra Fišerio kriterijumi ir empiriniais stebėjimais parodė, kad gauti rezultatai atspindi turimus eksperimentinius duomenis.
2. ALP negrįžtamosios katalizės atveju gauti parametrai: vmax = 0,000129 mM/s, KM = 4,27 mM, kcat = 303 s-1; ADH grįžtamosios katalizės atveju gauti parametrai: vmax = 0,00104 mM/s, KM = 28,7 mM, kcat = 7900 s-1.
Literatūra
Bagdonienė, L.; Bendikienė, V.; Kadziauskas, J.; et al. 2006. Biochemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: VU leidykla, 148—151.
Belitz, H. –D.; Grosch, P.; Schieberle, P. 2009. Food chemistry (4th revised and extended Ed). Heidelberg: Springer, 93—97, 117—137.
Bumelienė, Ž.; Chmieliauskaitė, V.; Galuckas, R.; et al. 2005. Bioinžinerija. Laboratoriniai darbai ir pratybos. Vilnius: Technika, 128—130, 190—198.
Cox, M. M.; Nelson, D. L. 2008. Principles of biochemistry (5th Ed). New York: W. H. Freeman and company, 183—215, 599.
Cornish-Bowden, A. 1975. The use of the direct linear plot for determining initial velocities. Biochemical Journal 149(2): 305—312.
Cornish-Bowden, A.; Darlison, M. G.; Storer, A. C. 1975. The nature of experimental error in enzyme kinetic measurments. Biochemical Journal 151(2): 361—367.
Kadziauskas J. Biochemijos pagrindai. 2008. Vilnius: VU leidykla, 79—101.
Lazdauskaitė, V.; Tamošiūnaitė, R; Juška., A. 2004. Produktu slopinamos fermentinės reakcijos eksperimentinis tyrimas ir matematinis modeliavimas [interaktyvus]. Vilnius: Technika [žiūrėta 2010 03 03]. Prieiga per internetą: .
engineering approach TO ENZYMe activity
S. Marcišauskas, A. Nestarenkaitė, A. Juška
Abstract
The activity of an enzyme depends solely on its efficacy and the affinity of the substrate for the enzyme. The enzyme, therefore, usually can be characterized
by two parameters, the catalytic constant and equilibrium dissociation constant. Initial rate of enzymatic reaction is usually determined from the tangent of product accumulation curve using only a small part of experimental data. Determining the dissociation constant usually involves coordinate transformation impeding the interpretation of results and often leading to uncontrollable errors. Such methods are not justified now when computers and computer programs are easily accessible. Mathematical mo-deling using the computers both helps understanding the processes and enables to estimate the parameters more accurately. In this investigation both the modeling and experiments were performed. Alkaline phosphatase (ALP) and alcohol dehydrogenase (ADH) were used for the investigation.
Keywords: ADH, ALP, catalysis, enzyme, Henri, mathematical modeling, product, substrate.
