A-kristalin dimerlarini qadoqlash

33 
xosligi, iii) fermentning barqarorligi va iv) triptik peptidlarning mass -
spektrometriya uchun mosligi kiradi. 
4. Peptidlar ionlashtiriladigan ifloslantiruvchi moddalarni yo'q qilish uchun 
tuzsizlantirilishi va ta'sir qilishi mumkin MALDI-TOF mass-spektrometriya. 
Peptidlarning massasini to'g'ridan-to'g'ri o'lchash oqsilni aniqlash uchun etarli 
ma'lumotni berishi mumkin (qarang) Peptidning ommaviy barmoq izlari) 
ammo peptidlarning ketma-ketligi haqida ma'lumot olish uchun ko'pincha mass 
spektrometr ichidagi peptidlarning keyingi parchalanishidan foydalaniladi. 
Shu bilan bir qatorda, peptidlarni tuzsizlantirish va ajratish mumkin teskari 
faza HPLC va an-orqali mass-spektrometrga kiritilgan ESI manba. LC-ESI-MS 
oqsillarni identifikatsiyalash uchun MALDI-MS ga qaraganda ko'proq 
ma'lumot berishi mumkin, ammo ko'proq vaqt sarflaydi. 
5. Mass spektrometr turiga qarab, peptid ionlarining parchalanishi turli xil 
mexanizmlar orqali sodir bo'lishi mumkin. To'qnashuv natijasida kelib chiqqan 
dissotsiatsiya (CID) yoki Manbadan keyingi parchalanish (PSD). Har ikkala 
holatda ham peptidning bo'lak ionlari naqshlari uning ketma -ketligi to'g'risida 
ma'lumot beradi. 
6. Bashoratli peptid ionlarining va ularning parchalanadigan ionlarining 
o'lchangan massasini o'z ichiga olgan ma'lumotlar, keyinchalik kontseptual 
(silikodagi) proteolizdan olingan oqsillar ketma-ketligi va ma'lumotlar 
bazalarining parchalanishidan hisoblangan massa qiymatlariga mos keladi. 
Muvaffaqiyatli o'yin, agar uning natijasi tahlil parametrlari asosida chegara 
qiymatidan oshsa topiladi. Haqiqiy oqsil ma'lumotlar bazasida namoyish 
etilmagan bo'lsa ham, xatolarga chidamli moslik oqsilni o'xshashligi asosida 
taxminiy identifikatsiyalashga imkon beradi. gomologik oqsillar. Ushbu 
tahlilni amalga oshirish uchun turli xil dasturiy ta'minot to'plamlari mavjud.
7. Dasturiy ta'minot to'plamlari odatda har bir aniqlangan oqsilning 
identifikatsiyasini (qo'shilish kodini), uning mos kelishini ko'rsatadigan 
hisobotni tuzadi va bir nechta oqsillar aniqlangan joyda mos keladigan 
kuchning o'lchovini beradi. 

34 
8. Belgilangan oqsilning ketma-ketligi bo'yicha mos keladigan peptidlarning 
diagrammasi ko'pincha ketma-ketlikni qoplashni ko'rsatish uchun ishlatiladi 
(peptid sifatida aniqlangan oqsilning%). POI mos keladigan oqsildan sezilarli 
darajada kichikroq deb hisoblangan joyda, POI aniqlangan oqsilning N - yoki 
C-terminal bo'lagi ekanligini taklif qilishi mumkin. 
Peptidning parchalanish modeli uning ketma-ketligini to'g'ridan-to'g'ri 
aniqlashga imkon beradi de novo ketma-ketlik. Ushbu ketma-ketlik oqsillar 
ketma-ketligining ma'lumotlar bazalariga mos kelish yoki tekshirish uchun 
ishlatilishi mumkin tarjimadan keyingi yoki kimyoviy modifikatsiyalar. 
Yuqorida aytib o'tilganidek, oqsillarni aniqlash uchun qo'shimcha dalillar 
keltirishi mumkin. 
Proteinni identifikatsiya qilish paytida mos keladigan peptidlar, mos keladigan 
oqsil uchun bashorat qilingan N- yoki C-terminini o'z ichiga olmaydi. Buning 
sababi, N- yoki C-terminal peptidlarni MS tomonidan aniqlash qiyin (masalan, 
juda qisqa yoki juda uzun), translyatsiyadan so'ng o'zgartirilgan (masalan, N -
terminalli asetilatsiya) yoki bashoratdan chinakam farq qiladi. Translatsiyadan 
keyingi modifikatsiyalar yoki qisqartirilgan terminlar ma'lumotlarni batafsil 
o'rganish orqali aniqlanishi mumkin (ya'ni.) de novo ketma-ketlik). Har xil 
o'ziga xoslikdagi proteaza yordamida takroriy hazm qilish ham foydali bo'lishi 
mumkin. 
Translatsiyadan 
keyingi 
modifikatsiyani 
aniqlash 
uchun 
MS 
ma'lumotlarini ma'lum oqsillar ketma-ketligiga asoslangan bashoratlar bilan 
batafsil taqqoslashdan foydalanish mumkin, shuningdek ma'lumotlar yig'ish 
uchun 
maqsadli 
yondashuvlardan 
foydalanish 
mumkin. 
Masalan, 
fosfopeptidlarning 
o'ziga 
xos 
boyishi 
aniqlashda 
yordam 
berishi 
mumkin fosforillanish oqsil tarkibidagi joylar. Mass-spektrometrda peptid 
parchalanishining alternativ usullari, masalan ETD yoki ECD, qo'shimcha 
ketma-ketlik ma'lumotlarini berishi mumkin. 
Proteinning butun massasi uning aminokislota qoldiqlari massasi va suv 
molekulasi massasining yig'indisidir va har qanday translyatsiyadan keyingi 

35 
modifikatsiyalar uchun sozlangan. Garchi oqsillar ulardan olingan peptidlarga 
qaraganda kamroq yaxshi ionlashtirsa-da, eritmadagi oqsil ESI-MS ta'siriga 
tushishi va uning massasi 20000 dan 1 qismgacha aniqlikda o'lchanishi 
mumkin. Bu ko'pincha terminini tasdiqlash uchun etarli bo'ladi (shuning uchun 
oqsilning o'lchangan massasi uning ketma-ketligidan bashorat qilinganiga 
to'g'ri keladi) va translyatsiyadan keyingi ko'plab modifikatsiyalar mavjudligi 
yoki yo'qligi haqida xulosa chiqarish. 
Proteoliz har doim ham POI ketma-ketligini qamrab oladigan, osonlikcha 
tahlil qilinadigan peptidlar to'plamini beravermaydi. Mass spektrometrdagi 
peptidlarning parchalanishi ko'pincha har bir peptid bog'lanishida bo'linishga 
mos keladigan ionlarni hosil qilmaydi. Shunday qilib, har bir peptid uchun 
chiqarilgan ketma-ketlik to'liq bo'lishi shart emas. Parchalanishning standart 
usullari leytsin va izoleysin qoldiqlarini izomerik bo'lgani uchun ajratmaydi.
Edman degradatsiyasi oqsilning N-terminalidan kelib chiqqanligi sababli, agar 
N-terminusi kimyoviy o'zgartirilgan bo'lsa (masalan, atsetilatsiya yoki 
Piroglutamik kislota hosil bo'lishi bilan) ishlamaydi. Edman degradatsiyasi 
odatda disulfid ko'priklarining holatini aniqlash uchun foydali emas. Bundan 
tashqari, sezgir natijalar uchun 1 pikomol yoki undan yuqori peptid miqdori 
talab etiladi, bu esa undan kam sezgir bo'ladi mass-spektrometriya. 

Download 0,7 Mb.