37
Экстракцию ДНК проводили стандартным фенол-хлороформным
методом с использованием растворимой протеиназы К из грудных плавников
(Sambrook J., Russell D.W., (2001)).
Для ПЦР-амплификации гена
митохондриальной цитохромоксидазы I (COI) Ivanova et al. (2007)
использовали предложенные праймеры VF2_t1 TGT AAA ACG ACG GCC
AGT CAA CCA ACC ACA AAG ACA TTG GCA C и FR1d_t1 CAG GAA ACA
GCT ATG ACA CCT CAG GGT GTC CGA ARA AYC ARA A. Продукты ПЦР
состояли из 10 нг образца ДНК, по 1
μl
каждого праймера, 12,5
μl
Taq Master
Mix (Новопротеин, Гуандун, Китай) и ddH2O, всего 25
μl
. Последовательность
термоциклических процессов в ПЦР была следующей: первые 3 мин. 94°С;
после этого 20 секунд, всего 35 циклов. 94°С, 45 сек. 54°С и 1 мин. 10 сек. 72°C
и финальный процесс 7 мин. 72°С продолжалось.
Секвенирование проводили в прямом и обратном направлениях с
использованием праймеров VF2_t1 и FR1d_t1. Последовательности COI
других видов
Gobio
были получены из NCBI GenBank. В
качестве внешней
группы использовался
G. conocephalus
. Затем были рассчитаны генетические
расстояния (K2P) и построено дерево максимального правдоподобия (ML) с
1000 бутстреп-репликациями с использованием MEGA 7 для изучения
филогенетического сходства (Kumar, S. et al., (2016)). Анализ байесовского
вывода (BI) проводился с использованием MrBayes 3.2 (Ronquist, F. et al.,
(2012)).
Филогенетическое дерево молекулярного анализа показало
G. nigrescens
из реки Зарафшан (инвентарные номера GenBank: MN810111, MN810112)
G.
nigrescens
из реки Хари в Иране (расстояние K2P 0,54%) и
G. sibiricus
из
бассейна рек Сурхандарьи (GenBank) инвентарный номер: MN810110) из реки
Обь (Россия), обнаружена во взаимной кладе с
G. sibiricus
(расстояние K2P
0,51%) из реки Иртыш и озера Балхаш (Казахстан).
G. sibiricus
и
G. lepidolaemus
(уникальные номера GenBank: MN810113,
MN810114), распространенные во внутренних
водоемах Узбекистана, очень
близки друг к другу и отличаются расстоянием K2P 0,72%. Генетические
различия между последовательностями COI
G. nigrescens
и
G. sibiricus
по
сравнению с последовательностями COI
G. lepidolaemus
составили 6,34% и
7,01% соответственно.
Результаты исследований, проведенных на представителях рода
Gobio
,
показали, что
G. sibiricus
и
G. nigrescens
обитают на рек Обь и Енисее. Помимо
встречи в реках Нура и Хари, он впервые отмечен также в бассейне Амударьи.
Наши молекулярно-филогенетические исследования
также подтвердили
утверждение о том, что
G. nigrescens
не близок к
G. gobio
.Рис. 7.
