• DENEY İÇİN GEREKLİ OLAN MALZEMELER
  • DENEYİN YAPILIŞI
  • Agaroz Jel Elektroforez İçerik




    Download 20.38 Kb.
    Sana24.03.2017
    Hajmi20.38 Kb.


    İçerik



    Tanım 2

    Agaroz jel elektroforezi için gerekli malzemeler 3

    Agaroz jel elektroforez metodu 4

    Jel hazırlama 4

    Hazırlanan jelin yürütülmesi 7

    Jel görüntüleme 8




    TANIM
    Ayırıcı bir matriks olan agaroz jel içerisinde elektriksel alana maruz bırakılan, DNA veya RNA parçalarının büyüklüklerine göre ayrıştırılmasına denir. Nükleik asit fragmentlerinin tanımlanması, saflaştırılması ve ayrılması için kullanılan en yaygın yöntem agaroz jel elektroforezidir. Ayırıcı matriks olan agaroz jeli agaroz ve tampondan oluşmaktadır. Bu yöntem kullanılarak PCR ürünlerinin, izole edilen DNA’ların, restriksiyon enzim kesimi sonucu oluşan ürünlerin, sekans işlemi için hazırlanan ürünlerin boyutlarının kontrolü ve yoğunluğu belirlenebilmektedir.

    DENEY İÇİN GEREKLİ OLAN MALZEMELER

    a. Agaroz

     Ticari olarak bulunur. Kırmızı alglerden izole edilir.

    b. 10X TBE (Tris-Borate electrophoresis buffer) YADA

     108 g Tris baz [tris(hydroxymethyl)aminomethane] + 55 g borik asit + 7.5 g

    EDTA, disodium tuz

    c. 10X TAE (Tris-Acetate-EDTA)

     48.4 g Trizma baz + 20 ml 0.5 M EDTA pH 8.0 + 11.44 ml glasial asetik asit

    d. Jel yükleme boyası

     50 mM EDTA + 0.2% SDS + 50% gliserol + 0.05% w/v bromfenol mavisi

    e. DNA standardı

     Boyutları ve yoğunlukları bilinen DNA fragmanlarıdır. Moleküler belirteç

    olarak kullanılır.

    f. Etidyum bromür (EtBr) (5 mg/ml)

     DNA sarmal yapısına bağlanarak jelde yürüyen DNA’nın görüntülenmesini

    sağlar.


    g. Elektroforez ekipmanları

     Jel dökme standı

     Taraklar

     Agaroz jel kuyusu oluşturmak için

     Yürütme tankı

     Güç kaynağı


    DENEYİN YAPILIŞI

    1. Agaroz jel hazırlanması

    a. %0.8’lik agaroz jel hazırlamak için 0.4 gram agaroz tartılarak 50 ml 1X TAE

    veya 1X TBE içerisine konulur.



    b. Mikrodalga fırında agaroz tamamen eriyene kadar kaynatılır.




    c. Elle dokunulabilir sıcaklığa gelinceye kadar sogutulur ve içerisine son

    konsantrasyonu 0.5 μg/ml olacak şekilde etidyum bromür eklenir.




    d. Kabarcıkların oluşmamasına dikkat ederek karıştırılır.
    2. Jel dökme standının hazırlanması.


    a. Jel tarakları elektroforez tankında uygun yerlere yerleştirilir.
    b. 3-5 mm kalınlığında bir jel dökülür.


    c. Jelde hava kabarcığı olmamasına dikkat edilir. Eğer hava kabarcığı varsa

    mikropipet ucu ile uzaklaştırılır

    d. Tamamen donduktan sonra taraklar kuyucukların bozulmamasına özen

    gösterilerek çıkartılır ve jel içerisinde 1X TAE veya 1X TBE bulunan tanka

    aktarılır.

    e. Tampon çözeltisinin agaroz jeli 1mm geçmesi yeterlidir.


    3. Örneklerin agaroz jel kuyularına yüklenmesi





    1. İlk kuyuya DNA standartı yüklenir.


    b. Diğer kuyulara örnekler yükleme boyası ile karıştırılarak yüklenir.
    4. Elektrotların uçları doğru şekilde yerleştirilir. Voltaj 1-5 V/cm olacak şekilde

    hesaplanır.



    5. Yükleme boyası jelin 2/3’ükadar yürüdüğünde yürütme durdurulur.



    6. Jel transiluminatör cihazı açılarak UV ışığında yürütülen DNA gözlemlenir.







    Download 20.38 Kb.

    Bosh sahifa
    Aloqalar

        Bosh sahifa


    Agaroz Jel Elektroforez İçerik

    Download 20.38 Kb.