2.1 Kichik plazmidalar, bakteriofaglar va kasmidalardan yot genlarni klonlashda vektor sifatida foydalanish
Eco R1 yopishqoq uchli fragmentlar hosil qilishi ma’lum bo’lgandan keyin har xil DNK fragmentlarini sistematik klonlash usuli topildi. Uning asosiga Eco R1 -fragmentli DNK molekulasini halqali plazmida DNK kiritish yotadi.
Bu gibrid plazmida hosil bo’lishiga olib keladi, uni bakteriya hujayrasiga kiritish mumkin. Bunda har bir hujayra uzida yot DNK fragmentini biriktirgan plazmidagi kiritishi mumkin. Birinchi shunday ekperimentlarda E.colining rSC101 plazmidalidan foydalanildi, chunki u Eco R1 parchalanishini bitta saytiga ega va demak u restriktaza ta’sirida chiziqli molekulaga aylanadi. Bunday DNK xuddi shunday yopishqoq uchli yot DNK bilan aralashtirilganda yangi gibrid plazmida hosil bo’ladi. Ularning har birida xech bo’lmasa yot DNK fragmenti bo’lib, plazmidaning Eco R1 saytiga birikib olgan bo’ladi.
Izlanuvchi vektor xususiyatini hujayra xususiyatlariga moslashtirishi zarur. Vektorda genetik marker bo’lib, shunga qarab seleksiya o’tkazish mumkin. Prokariot sistemalarda ko’pincha bu har xil antibiotiklar - ampisilin, tetrasiklin v. xzoga chidamlilik markeri mavjud. Xo’jayin-hujayrasi rekombinant DNK molekulasi funksiyalashning uchun eng birinchi muhitdir. Hozirgi vaqtda ko’pincha E.coli, B.subtilis, achitqi va boshqa mikroorganizmlar qo’llaniladi.
Rekombinant DNK hujayraga kiritilgandan keyin (transformasiya) molekulyar klonlashtirish, ya’ni hosil qilini rekombinant DNK avlodini olish boshlanadi. Buning uchun transformasiyalangan hujayralar o’sishi uchun sharoit yaratiladi. Masalan: muhitga u yoki bu antibiotik kushiladi. Oxirida absolyut gomogen shtamm olinadi, undan quyilgan maksadi karib klonlangan gen yoki uning mahsuloti ajratib olinadi.
Plazmidli vektor pBR322 2 xil genetik markerni uz ichiga oladi ampisillin (AR) va tetrasiklin(Ts) antibiotiklariga rezistentlik. Restriksiyalovchi endonukleazalar Bam HI yordamida polinukleotid xalka Te geni qismida uziladi-kesiladi. Natijasida 5'-GATCli yopishqoq uchlar paydo bo’ladi va Te gen inaktivlanadi.5'-GATC uchli sintetik gen olinadi. Bu gen va uzilgan vektor pBR322 ligaza T4 fermenti yordamida uzilgan bog’lar tiklanadi va aksariyat hollarda sintetik gen vektorga birikladi va rekombinant DNK hosil qiladi(8-rasm).
Aralashmada endi ikki xil navli siklik molekulalar - pBR 322 vektorlari va rekombinant gen tashuvchi plazmidalar bo’ladi.
Ular ampisillinga rezistent (chidamili), lekin vektor tetrasiklinga ham rezistent bo’ladi, rekombinant plazmidalar esa aknlcha chidamsizdir.
Bu esa selektiv muhitda kerakli geni bo’lgan rekombinantlarni ajratish imkonini beradi. Gen injeneriyasi uzining birinchi kadami bilan yangi kutilmagan xodisalarni ochdi.
Bunday yangiliklarga birinchi navbatda eukariot genlarning mozaik strukturasi kiradi,ya’ni ular oqsilni kodlovchi qism (ekzonlar) va oraliq (intron) , oqsilga aloqasi bo’lmagan qismlardan iboratligi aniklandi.
Genlarning mozaik strukturasining aniklanishi muhim ahamiyatga ega bo’ladi, u avval ma’lum bo’lmagan iRNKning hosil bo’lish etapini ochishga olib keldi, ya’ni birlamchi nusxadan intronning kesib olinishi va ekzonning biriktirib iRNKning oxirgi shakllangannin olishga olib keldi.
DNKni plazmida tarkibida klonlab xromosoma genlarining strukturasini to’g’ridan- to’g’ri urganish mumkin, lekin ulardan transkripsiyalanadigan mRNKni emas. Lekin kodlanadigan gendan tashkarida bo’lgan regulyasiyalaydigan tartiblarni urganish uchun xromosoma DNKsining ancha uzun fragmentlari bilan manipulyasiya qilishga to’g’ri keladi. Amalda minglab ximera plazmida olish mumkin, ularning har biri DNK (odam, sichqon, tovuq)ning spesifik fragmentlariga ega bo’ladi. Ko’p sondagi bunday plazmidalarini skrininglab bu organizmlarning to’liq genomini o’rganish mumkin. Lekin katta DNK bo’lagiga ega bo’lgan plazmida barkaror bo’lmaydi, replikasiyada sekin asta kichrayib boradi, ya’ni delesiya natijasida yot DNK nukleotidlari soni kamayib boradi. Buning sababi shundaki, plazmida kancha kichik bo’lsa shuncha tez replikasiyalanadi. Shu sababli plazmida ko’payishi uchun kerak bo’lmagan genetik material tez yo’qoladi. Delesiya chastotasi kDNK klonida bir necha mingdan ko’p nukleotidlar bo’lsa ancha ortadi.
Xromosoma DNKsining katta bo’lanlari (15 kv) plazmida tarkibida juda ham barqaror emas, lekin ularni biz maxsus konstruksiyalangan L fagi shtammlariga biriktirsak ancha barqoror bo’lib qoladi.
Faglar eukariotlarining spesifik genlariga ega bo’lgan, "bibliotekasi" olinandan keyin uni plazmidaga klonlangan kDNK yordamida oson skrisninglash mumkin. Bunda ham radioaktiv nishonlanganlangan zondlar yordamida kDNKga komplementar tartibga ega bo’lgan fag koloniyalari identifikasiyalanadi. Sut emizuvchilar gaploid nabor xromosomalari 3*10 juft asoslarga ega. DNK L fagga klonlanganda har bir fragment o’rtacha 1,5*10 juft nukleotidda iborat bo’ladi. Shunday qilib faqat 1mln fagning skrining sut emizuvchilarning butun genomini urganish imkonini beradi. Agar spesifik kDNK bo’lsa, kerakli genni Lfagi bibliotekasidan topish ko’pi bilan bir necha xafta vaqtni oladi (9-rasm)
Fagda klonlangandi eukariotik genom segmentining o’lchovi 15kv bilan chegaralanadi. Ko’p xollarda bu butun gen va u bilan boglik tartiblar olish uchun etarlidir. Lekin izlanishlar shuni kursatadiki ko’p genlar ancha uzun bo’lib ular 35-40 kv nukleotidlarga ega bo’ladi. Undan tashkari L fagida klonlab odatda 2ta yakin turgan genlardan rekombinant DNK ajratish mumkin emas. Juda uzun eukariotip DNK fragmentlarini E.colida klonlash kasmidalarda olib boriladi. Bu usul shuncha asoslangaki L fag DNKsi 2ta uchida komplementar bir zanjirli qism bo’lib unga cos-sayt deb ataladi. Fagning normal hayotiy siklida fagning yuzlab DNK molekulalari uzun zajiirga birikadi, ya’ni konkotamerga birikadi, bunda L fagi har biri boshqasi bilan cos-sayt bilan birikkan bo’ladi.
Fag DNKsini joylashishini (ulolovka) katalizlovchi fermentlar bu konkatemerda 2ta bir biridan 35-45 kv mosofada turgan cos-saytlarni toniydi va ular oraligida turgan fag genomini kesib ajratadi va uni fag boshchasiga joylashtiradi. Shunday qilib cos-sayt bu DNKni fag boshchasiga joylashishida muhimd (10-rasm).
Lfagi cos-sayti pBR322 plazmidaning ampisillinga chidamliligiga klonlanib, tetrasiklinga chidamlilik gen faol saqlanib qoladi. Eukariotik DNK-restriktaza yordamida kisman gidrolizlanadi. Bunda nisbatan uzun DNK fragmentlari hosil bo’ladi. Keyin bu fragmentlar aralashmasi plazmidaning cos-sayti bilan biriktiriladi. Sos-sayt ham shu ferment yordamida gidrolizlanadi. Bunda intakt TetR genni intakt DNK ximera aralashmasi hosil bo’ladi. Bu aralashmada eukariotik DNK fragmenti cos-sayt bilan tugagan.
Bu aralashmaga L fagi DNKsini joylashishini katalizlovchi ekstrakt qo’shilganda, 35-45 kv eukariotik DNK fragmentlarini taniydi va ajralish sodir bo’ladi va ular fag boshchasiga joylashadi. Eukariotik DNKning qisqa fragmentlari ularda cos-sayt bo’lsa ham fag boshida joylashmaydi. Bunday DNKli fag boshchasi anikki ko’paya olmaydi . Sungra ular bilan ishlov berilgan E.coli tetrasiklinga chidamliligi buyicha tanlanadi. E.coli ichiga tushgandan keyin gibrid molekula plazmida kabi ko’payadi. Kasmidalarda klonlash effektivligi fagga qaraganda past va kosmida bibliotekasini kam miqdorda DNK bo’lgan organizmlar bilan ishlaganda olish qulay (masalan: drozofila).
| 