Biotexnologiya Rekombinant DNK texnologiyasi
o’quv-uslubiy majmua
Ma’ruza rejasi
Rekombinat DNK texnologiyasi
Rekombinant DNK olish usullari
Genlarni klonlash
TAYANCH SO’ZLAR: Gen, ekspressiyasi, r DNK, Plazmidalar, bioyehnologiya, Nuklein kisloyalar, Genom, Ribosoma, Bakteriofaglar,Gen muhandisligi, r DNK , Transgen hayvonlar.
Sun’iy sharoitda rekombinant DNK olish va genlarni klonlash ilk bor 1972 yilda AQSH olimlari Boyer va Koen tomonidan amalga oshirilgan. Bu olimlar E.coli bakteriyasining xromosoma DNK siga va shu bakteriya plazmidasiga alohida idishlarda EcoRI restriktaza fermenti bilan ishlov berganlar. Plazmida tarkibida faqat 1 dona EcoRI restriktaza fermenti tanib kesadigan maxsus nukleotidlar ketma-ketligi bo‘lganligi sababli ferment plazmidaning xalqasimon DNK qo‘sh zanjirini faqat bir joydan kesib, plazmidani «yopishqoq« uchli ochiq holatga o‘tkazadi. Xromosoma DNK molekulasida EcoRI restriktaza fermenti taniy oladigan maxsus nukleotidlar ketma-ketligi qancha bo‘lsa, bu molekula shuncha bo‘lakka bo‘linadi.
Turli xil o‘lchamga ega bo‘lgan DNK molekulasi elektroforez uslubi yordamida ajratib olinadi. Ajratib olingan «yopishqoq» uchli xromosoma DNK si bo‘lagi ochiq holatdagi “yopishqoq” uchli plazmida DNK si bilan aralashtirilib ligaza fermenti yordamida tikiladi (ulanadi). Natijada plazmida tarkibiga xromosoma DNK bo‘lagi kiritiladi.
Shu boisdan rekombinant DNK ga quyidagicha tarif berish mumkin: har qanday tirik organizm irsiy molekulasining istalgan bo‘lagini vektor molekulalariga birikishdan hosil bo‘lgan sun’iy DNK - rekombinant DNK deyiladi.
Rekombinant DNK olishning uchta usuli mavjud:
- konnektor usuli;
- restriktaza-ligaza;
- linker molekulalaridan foydalanish usuli.
Konnektor usulida - rekombinatsiyada ishtirok etuvchi DNK bo‘lagining 3' uchiga dezoksinukleotidil-transferaza fermenti yordamida ma’lum uzunlikdagi oligo (dA) - segmenti ulanadi. Ikkinchi uchiga esa oligo (dT) - segmenti ulanadi. Bu DNK bo‘laklari aralashtirilganda dA va dT segmentlarning vodorod bog‘lari asosida komplementar birikishi tufayli xalqasimon DNK strukturasi hosil bo‘ladi. Hosil bo‘lgan DNK dagi bir zanjirli bo‘sh joylar DNK-polimeraza I fermenti yordamida to‘ldiriladi.
Restriktaza-ligaza usuli - rekombinant DNK olishning eng sodda va oson usuli hisoblanadi. Bu usulda DNK molekulasi va vektor plazmida «yopishqoq» uchlar hosil qiluvchi restriktaza bilan qirqiladi va aralashtirilgan holda ma’lum sharoitda reassotsiatsiya qilinadi. Komplementarlik xususiyatiga ko‘ra DNK molekulalari o‘zaro vodorod bog‘lari yordamida birikib xalqasimon struktura hosil qiladi va DNK zanjirining birikmagan joylari DNK-ligaza fermenti yordamida ulanadi.
Linker molekulalaridan foydalanish usulida - DNK molekulasiga va vektor plazmidaga T4 fag DNK-ligaza fermenti yordamida maxsus nukleotid ketma-ketligiga ega bo‘lgan linker molekula ulanadi. Olingan ikki turdagi DNK molekulasi restriktaza fermenti yordamida qirqilib, aralashtirilgan holda qaytadan assotsiatsiya qilinadi. DNK va vektor plazmida molekulalarining birikmagan joylari DNK-ligaza fermenti yordamida ulanadi. SHu yo‘sinda rekombinant DNK molekulasi hosil bo‘ladi. 1
VEKTOR MOLEKULALAR, GENLAR BANKINI YARATISH VA ALOHIDA GENLARNI AJRATISH TEXNOLOGIYASI
Rekombinant DNKni avtonom replikatsiya bo‘lishi uchun javob beradigan DNK bo‘lagi - vektor molekulalari deyiladi.
Vektor molekulalar o‘z vazifasiga ko‘ra ikki tipga bo‘linadi:
Birinchisi -avtonom replikatsiya bo‘luvchi vektorlar.
Ikkinchisi - xromosomaga integratsiya bo‘luvchi vektorlar.
Vektor molekulalar gen muhandisligi biotexnologiyasida genlarni klonlashda va transformatsiya qilishda asosiy ish quroli bo‘lib xizmat qiladi. Vektor molekulalari vazifasini fag DNK lari, plazmidalar va o‘simliklarni xloroplast hamda mitoxondrial DNK lari o‘tashi mumkin.
Xo‘jalik ahamiyati qimmatli bo‘lgan genlarni ajratish uchun gen banki tuziladi. Xromosomal DNK asosida gen bibliotekasini tuzish quyidagicha amalga oshiriladi:
DNK va vektor molekulalar restriktaza fermenti yordamida qirqiladi va ma’lum sharoitda qaytadan assotsiatsiya qilinadi;
Nukleotidlar orasida ulanmay qolgan bo‘shliq DNK-ligaza fermenti yordamida o‘zaro biriktiriladi;
Olingan rekombinant DNK bakteriya hujayrasiga transformatsiya qilinadi.
Xromosomal DNK da mavjud genlarni to‘la klonlash uchun DNK o‘lchamiga va olingan klonlarni soniga e’tibor berish kerak.
Genlarni klonlashda ko‘pincha kDNK bibliotekasini tuzish maqsadga muvofiqdir. Bu holda maxsus poli (Y) va oligo (dT) kolonkalari yordamida uchlarida poli (A) nukleotidlar ketma-ketligini saqlovchi iRNK, tRNK va pRNK dan ajratib olinadi. Olingan iRNK molekulasi oligo (dT) nukleotidlari bilan aralashtirilib reassotsiatsiya qilinadi.
Bunda iRNK molekulasining poli (A) uchida dA-dT qo‘sh zanjirli segment hosil bo‘ladi. Ushbu ikki zanjirli segmentning oligo (dT) uchi kDNK sintezini amalga oshiruvchi revertaza fermenti uchun praymer (kDNK sintezining boshlanish nuqtasi) vazifasini o‘taydi.
Sintez qilingan kDNK molekulasi qisqa uchli ikki zanjirli struktura bilan tugallanadi. kDNK sintezida matritsa vazifasini o‘tagan iRNK molekulasi NaOH bilan parchalanadi, natijada qisqa ikki zanjirli va to‘liq iRNK molekulasiga komplementar bo‘lgan bir zanjirli kDNK molekulasi hosil bo‘ladi.
Hosil bo‘lgan qisqa ikki zanjirli struktura kDNK ning ikkinchi zanjirini sintez qilishda praymer vazifasini o‘taydi. DNK-polimeraza I fermenti yordamida kDNK ning ikkinchi zanjiri sintez qilinadi. Hosil bo‘lgan kDNK ning bir zanjirli qismi SI-nukleaza fermenti yordamida parchalanadi va ikki zanjirli kDNK molekulasi hosil bo‘ladi. SHu yo‘sinda hosil bo‘lgan kDNK molekulasi vektor molekulalariga ulangan holda klonlanadi.
Har ikki usul bilan yaratilgan genom bibliotekasidan individual genlarni ajratib olish quyidagicha amalga oshiriladi - rekombinant plazmida denaturatsiya qilinadi (1000S haroratda 5 min., 0,2 N NaOH eritmasida 15 min.), bir zanjirli DNK molekulasi stabil qo‘zg‘almaydigan holatda turishi uchun nitrotsellyuloza filtriga biriktiriladi. Olingan filtr [g-32P] ATF nukleotidi bilan nishonlangan iRNK molekulasi bilan gibridizatsiya qilinadi.
Molekulyar gibridizatsiya jarayonida filtrga birikkan rekombinant DNK molekulasiga komplementarlik qonuniyati asosida nishonlangan iRNK molekulalari birikadi.
Hosil bo‘lgan gibrid DNK molekulasi denaturatsiya qilinib, nishonlangan iRNK molekulasi ajratib olinadi (elyusiya yordamida). Olingan iRNK molekulasi hujayrasiz oqsil sintez qilish tizimida tekshirib ko‘riladi. Hosil bo‘lgan oqsil molekulasini identifikatsiya qilish yo‘li bilan individual genlarni ajratib olish amalga oshiriladi.2
Nazorat uchun savollar:
Rekombinant DNK olishning qanday usullari mavjud?
Rekombinant DNK olish texnologiyasi ilk bor qaysi olimlar tomonidan amalaga oshirilgan?
Restriktaza-ligaza usulida rekombinant DNK olishning mohiyatini tushuntiring
Vektor molekulasi
Vektor molekulalari qanday guruhlarga bo’linadi?
| 