mgr Agata Karolina Królikowska Warszawa, dn. 19.06.2009
Autoreferat rozprawy doktorskiej
„Zastosowanie spektroskopii podczerwieni i Ramana do charakterystyki białek zaadsorbowanych na powierzchniach Ag i Au modyfikowanych tiolami”
(„Application of Ir and Raman spectroscopy for characterization of the proteins adsorbed on thiol modified Ag and Au surfaces”)
Promotor: prof. dr hab. Jolanta Bukowska
Białka redoks zaadsorbowane na powierzchni elektrod metalicznych stanowią w ostatnich latach obiekt licznych badań. W tej dziedzinie dokładne rozpoznanie mechanizmu i dynamiki procesów na granicy faz, a zwłaszcza reakcji przeniesienia elektronu między fazami jest jednym z kluczowych aspektów. Pokrycie powierzchni metalu cienkim filmem organicznym w celu adsorpcji biomolekuł pozwala zapobiec ich denaturacji i zachować aktywność biologiczną. Samoorganizujące monowarstwy ω-podstawionych alkanotioli na powierzchni Ag i Au są doskonałymi monowarstwami łącznikowymi do wiązania białek i enzymów. Dotychczasowe doniesienia literaturowe dowodzą, że cytochrom c (cyt c) jest elektroaktywny w wielu układach wykorzystujących złoto i srebro pokryte alkanotiolami do jego unieruchomienia na powierzchni, jednakże dokładne rozpoznanie związku między cechami strukturalnymi monowarstwy i efektywną komunikacją elektryczną między elektrodą a cyt c stanowi nadal wyzwanie. Zrozumienie mechanizmu przeniesienia elektronu promowanego przez monowarstwę tiolową dla prostego białka redoks (cyt c) może pozwolić na identyfikację parametrów rządzących procesem przeniesienia elektronu w ogólności i na udoskonalenie jego praktycznych zastosowań, tj.: optymalizacja elektrod enzymatycznych lub konstrukcja biosensorów.
Celem rozprawy było uzyskanie informacji o strukturze oraz właściwościach redoks cyt c zaadsorbowanego na powierzchni srebra i złota, modyfikowanych jedno- i dwuskładnikowymi monowarstwami ω-podstawionych alkanotioli. Podjęto próbą korelacji wyników dotyczących kinetyki przeniesienia elektronu między cyt c a pokrytym tiolem metalem i danych strukturalnych na temat badanego układu (białka oraz tiolowych monowarstw łącznikowych) uzyskanych z eksperymentu spektroskopowego. W badaniach cyt c na powierzchni Ag wykorzystano spektroskopię SERRS, będącą połączeniem efektów powierzchniowo wzmocnionego rozproszenia ramanowskiego (SERS) oraz rezonansowego efektu Ramana (RR). Dostrojenie linii wzbudzającej do energii przejścia elektronowego w hemie pozwoliło na uzyskanie informacji o stanie redoks, konformacji spinowej i liczbie koordynacyjnej atomu Fe hemowego oraz orientacji hemu względem elektrody. W przypadku pomiarów na powierzchni elektrody Au niemożliwa jest dla badanego układu jednoczesna kombinacja efektu SERS i RR. Z tej przyczyny posłużono się metodami odbiciowej podczerwieni, wykorzystującej zewnętrzne odbicie (IRRAS) oraz całkowite wewnętrzne odbicie (ATR), ze szczególnym uwzględnieniem techniki spektroelektrochemicznej: powierzchniowo wzmocnionej odbiciowej absorpcji w podczerwieni (SEIRA). W tym przypadku uzyskane dane spektroskopowe wnoszą informacje na temat matrycy białkowej cytochromu.
Właściwości łącznikowych monowarstw tiolowych na Ag i Au przebadane zostały za pomocą spektroskopii SERS oraz SEIRA. Wykonano pomiary SERRS dla cyt c unieruchomionego na powierzchni srebra modyfikowanego jednoskładnikowymi monowarstwami następujących ω–podstawionych alkanotioli: merkaptoetanosulfonianu sodowego (MES), kwasu tioglikolowego (TGA) i 3-merkaptopropionowego (MPA), kwasu merkapto- (MSA) i dimerkaptobursztynowego (DMSA). Badano w jaki sposób wpływają na konfigurację spinową i stopień utlenienia żelaza grupy hemowej cyt c, właściwości redoks oraz orientację grupy prostetycznej białka następujące czynniki:
sposób związania cyt c z monowarstwą: kowalencyjne lub wykorzystujące oddziaływania elektrostatyczne (TGA, MSA, DMSA) oraz stopień zjonizowania monowarstwy (MPA)
pH roztworu białka: naturalne pH cyt c, pH obojętne, pH odpowiadające punktowi izoelektrycznemu cyt c (MES, TGA, MSA, DMSA)
niewielkie różnice strukturalne w obrębie cząsteczki tiolu (MSA i DMSA)
wpływ rozpuszczalnika z którego hodowana była monowarstwa: etanol lub woda (MSA, DMSA, TGA)
Przeprowadzone eksperymenty wykazały, że cechy strukturalne monowarstwy łącznikowej mają istotny wpływ na sposób immobilizacji cyt c, a w konsekwencji na jego właściwości redoks. Przykładowo zmiana rozpuszczalnika z którego hodowana jest monowarstwa z wody na etanol w przypadku monowarstw MSA na Ag wymusza konieczność kowalencyjnego związania białka, gdyż przy elektrostatycznym unieruchomieniu zachodzi niepożądane utlenianie żelaza hemowego. Przypuszczalną przyczyną jest niekompletne blokowanie powierzchni metalu przez MSA, nie obserwowane w przypadku adsorpcji z roztworów wodnych tiolu. Podobnie brak buforowania roztworu cyt c użytego do przyłączenia na MES skutkował utlenieniem cyt c i zmianą stanu spinowego. W przypadku TGA i DMSA zademonstrowano, że rozpuszczalnik użyty do hodowania monowarstwy (woda vs etanol) oraz sposób przyłączenia białka (elektrostatyczny vs kowalencyjny) ma wpływ na zachowanie redoks przyłączonego cyt c (potencjał odpowiadający utlenieniu białka oraz zmiany w sposobie ligacji hemu towarzyszące przemianie redoks). Porównanie właściwości cyt c zaadsorbowanego na monowarstwach MSA i DMA wykazało m.in. że monowarstwa DMSA skuteczniej niż MSA chroni białko przed niekorzystnymi zmianami stanu redoks, przypuszczalnie dzięki efektywniejszemu pokryciu powierzchni metalu, dzięki wiązaniu się za pomocą dwóch grup tiolowych do podłoża.
Monowarstwy MPA na Ag o różnym stopniu dysocjacji zastosowano do elektrostatycznego przyłączenia cyt c. Odkryto, że bardziej sprotonowana monowarstwa MPA pozwala na większą randomizację orientacji unieruchomionego białka, tym samym prawdopodobnie czyniąc łatwiej dostępną tę, ułatwiająca transfer elektronu. Tę zwiększoną swobodę rotacyjną dla monowarstwy SAM charakteryzującej się mniejszym ujemnym ładunkiem powierzchniowym powiązano ze wzrostem stałej szybkości przeniesienia elektronu obserwowanej dla analogicznych monowarstw MPA na złocie.
Pomiary SERS oraz SEIRA pozwoliły zaproponować model adsorpcji cząsteczki MSA na powierzchni srebra i złota. Rejestracja widma SEIRA pozwoliła określić zmiany w geometrii cząsteczki MSA (kąty nachylenia obu grup karboksylowych) na powierzchni Au w funkcji potencjału przyłożonego do elektrody. Adsorpcja MSA na złocie została dodatkowo przebadana za pomocą technik elektrochemicznych (woltamperometrii cyklicznej, pojemności różniczkowej, oraz chronokulometrii), co pozwoliło stwierdzić dwustopniowość procesu oraz wyznaczyć zmiany wartościowości elektrosorpcji (ładunek przypadający na zaadsorbowaną cząsteczkę) w funkcji potencjału. Eksperyment spektro-elektrochemiczny z użyciem techniki SEIRA wykonany dla cyt c zaadsorbowanego na złocie pozwolił zaproponować fragment aminokwasowy wiążący białko elektrostatycznie do złota pokrytego Au oraz stwierdzić postęp zmiany stanu redoks białka wymuszonej polaryzacją elektrody. Uzyskane wyniki wskazują na to, iż miejsce wiązania cyt c przez dwukarboksylowe pochodne alkanotioli oraz stopień swobody rotacyjnej unieruchomionego białka moga być inne niż dla ich monokarboksylowych odpowiedników.
Badano również przydatność mieszanych monowarstw tioli jako partnerów do immobilizacji cyt c, głownie pod kątem jak wpływa „rozcieńczenie” ładunku ujemnego monowarstwy za pomocą innej grupy funkcyjnej na przyłączenie białka oraz kinetykę przeniesienia elektronu. W tym celu wykorzystano dodatkowo merkaptoetanol (MEL) oraz merkaptoundekanol (MUL). Analizowane monowarstwy mieszane były sfunkcjonalizowane sulfonowymi i hydroksylowymi grupami terminalnymi, zaś łańcuchy alifatyczne składników były porównywalnej długości (MES/MEL) lub różniły się dość znacznie, stwarzając możliwość lokalnej segregacji fazowej (MES/MUL). Mieszane monowarstwy MES/MEL na Ag były testowane w celu elektrostatycznego przyłączenia cyt c dla xMES=0.5, 0.75, 0.88 i 0.92 (xMES- ułamek molowy MES w roztworze). Celem była korelacja cech strukturalnych i orientacji hemu unieruchomionego cyt c (wydedukowane z widm SERRS) z literaturowymi stałymi szybkości przeniesienia elektronu (kET) wyznaczonymi z pomiarów modulowanej potencjałem spektroskopii odbiciowej UV-vis, dla analogicznychmonowarstw na złocie Analiza względnej intensywności pasm drgań B1g do A1g wykazała dla próbek ex situ, że im niższy ułamek molowy SO3- (i tym samym niższa gęstość ujemnego ładunku powierzchniowego) w monowarstwie mieszanej, tym bardziej prostopadła orientacja grupy prostetycznej cyt c względem metalu, która jest uważana za ułatwiającą transfer elektronu. Ta obserwacja może tłumaczyć obniżenie kET dla xMES>0.5 w roztworze przygotowawczym, zaobserwowane w literaturze dla podłoża Au. Literaturowe wyniki obliczeń metodą dynamiki molekularnej wpływu stopnia dysocjacji terminalnej grupy karboksylowej monowarstwy na orientację hemu także wskazują na jego „prostowanie” przy spadku liczby grup COO- na powierzchni. Warto w tym miejscu podkreślić, że symulacje te pokazały także, że w przypadku ujemnie naładowanych monowarstw zbyt duża gęstość powierzchniowa ładunku może być źródłem zbyt silnych oddziaływań cyt c- monowarstwa, które mogą wywołać zmiany konformacyjne w strukturze drugorzędowej białka prowadzące nawet do denaturacji. W pracy wykazano odmienne właściwości zaadsorbowanego białka na monowarstwach MES/MEL o analogicznym składzie w obecności białka w roztworze (in situ) w stosunku do widm cyt c zarejestrowanych ex situ. Przypisano je tworzeniu się multiwarstwy białka, co potwierdzono przeprowadzając eksperyment in situ dla bardziej rozcieńczonego roztworu cyt c.
Dwuskładnikowe monowarstwy MES i MUL na Ag i Au adsorbowane z etanolowych roztworów przebadano w naszej pracowni przy użyciu technik desorpcji elektrochemicznej, skaningowej mikroskopii tunelowej (STM) oraz spektroskopii SERS pod kątem składu powierzchniowego i struktury. Dla podłoża Au(111) pomiary reduktywnej desorpcji wykazały, że prawdziwie dwuskładnikowe monowarstwy powstają dla ułamka molowego MES w roztworze większego niż 0.5. Ponadto na podłożu tym stwierdzono preferencyjną adsorpcję MUL. Dane SERS wskazują na odwrotną tendencję dla monowarstw na schropowaconym elektrochemicznie srebrze i złocie, tj. preferencyjną adsorpcję MES, silniej zaznaczoną na srebrze. Obecność dwóch wyraźnie rozseparowanych pików reduktywnej desorpcji oraz zdjęcia STM wskazują na rozdział faz i tworzenie domen utworzonych przez cząsteczki jednego tiolu dla udział MES w roztworze powyżej 0.5 ułamka molowego. Silny wpływ właściwości podłoża (rodzaju metalu oraz jego topografii) na skład i strukturę monowarstwy łącznikowej MES/MUL został wnikliwie przedyskutowany. Widma SERRS cyt c na mieszanych monowarstwach MES i MUL na Ag pokazały, że stopień utlenienia oraz konfiguracja spinowa zaadsorbowanego cyt c silnie zależą od składu monowarstwy. Planowane są pomiary STM mające zweryfikować prawdopodobną selektywną adsorpcję cyt c na nanometrowych domenach ujemnie naładowanego MES na powierzchni Au(111).
W ramach rozprawy zaproponowano również nowatorską metodę przyłączenia cyt c z wykorzystaniem cząsteczki aromatycznego ditiolu (4,4’- tiobisbenzenotiolu; TBBT), przebiegającą potencjalnie z wiązaniem wolnej grupy tiolowej do utlenionego atomu żelazahemowego i jej utlenieniem do postaci dwusiarczku. W przypadku TBBT na Ag nie stwierdzono obecności cyt c za pomocą techniki SERRS (przypuszczalnym powodem jest niski stopień uporządkowania monowarstwy, skutkujący w mniejszej dostępności niezwiązanych z powierzchnią grup tiolowych), podczas gdy dla złota używając techniki IRRAS potwierdzono związanie cyt c przez cząsteczki TBBT i nie wykluczono zaangażowania transformacji grup tiolowych TBBT w dwusiarczki podczas immobilizacji białka. Elektroaktywność tak unieruchomionego cyt c wymaga dalszej weryfikacji.
Techniki SER(R)S, IRRAS i SEIRA użyte w toku pracy dowiodły, że stanowią one doskonałe narzędzie do badania struktury i właściwości chemicznych łącznikowych monowarstw tiolowych oraz przyłączonego cyt c. Rezultaty uzyskane na drodze charakterystyki spektroskopowej dając wgląd w strukturę molekularną są uzupełnieniem tych uzyskanych z eksperymentów elektrochemicznych dla badanych układów, co może wspomóc interpretację właściwości redoks i przeniesienia elektronu dla cyt c unieruchomionego na podłożach metalicznych pokrytych tiolami. Wymieniając tylko kilka uzyskanych w toku rozprawy wyników można stwierdzić, że rozpuszczalnik użyty podczas adsorpcji monowarstwy, gęstość ładunku powierzchniowego, subtelne różnice strukturalne budulca monowarstwy, stopień dysocjacji i sposób przyłączenia białka mogą mieć wpływ na elektroniczne właściwości hemu i orientację grupy prostetycznej a zatem na właściwości redoks oraz mechanizm przeniesienia elektronu. Wykazano, że obecność nadmiarowej ilości białka roztworze może w niektórych przypadkach mieć wpływ na właściwości zaadsorbowanego cyt c. W przypadku monowarstw dwuskładnikowych struktura i skład monowarstwy może być zależna od rodzaju metalu oraz chropowatości podłoża, dlatego też bardzo częste porównywanie wniosków ze spektroskopii SERRS dla cyt c przyłączonego do Ag pokrytego tiolami z danymi elektrochemicznymi uzyskanymi dla Au(111) musi być przeprowadzane ostrożnie i świadomie. Połączenie spektroskopii oscylacyjnej in situ i metod elektrochemicznych (zwłaszcza dla tego samego podłoża) zapewnia dogłębne zrozumienie struktury i właściwości charakteryzujących przeniesienie elektronu unieruchomionego białka redox, stanowiąc nieocenione narzędzie w celu wyjaśnieniu mechanizmu przeniesienia elektronu oraz projektowania nowoczesnych urządzeń elektronicznych.
|
