22 – ish: Agarozali gelda DNK elektroforezi
Asbob-uskunalar va materiallar. Eletroforez apparati, gelda chuqurcha hosil qiluvchi taroqcha, doimiy tok manbai, 120 ml 0,8% li agaroza, 0,5 l elektroforez buferi, antkonvektsion eritma (namuna miqdoridan 1/4 - 1/5 mg/ml) 300 ml etidiy bromidli bo‘yovchi modda (0,5 mg/ml), rezina qo‘lqop, ximeskop, fotoapparat, sariq yoki sabzi rangli filьtr, ob'ektiv uchun uzunlashtiruvchi xalqa, plyonka, foto bochka, standart proyavitel va standart mustahkamlovchi (13-rasm).
Mavzuni tushuntirish. DNK agarozali gel elektroforezida molekulalarining o‘lchamiga va konformatsion holatiga qarab bo‘linadi. DNK molekulalarining geldagi yurish tezligi uning o‘lchami logarifimiga teskari proportsionaldir, demak ularning molekulyar og‘irligiga ham berilgan kattalikdagi DNK molekulalarining gelda yurish tezligi-geldagi agaroza miqdoriga ham bog‘liq. Molekulalarning samarali bo‘linishi uchun agaroza miqdorini to‘g‘ri tanlash lozim. Buni 3-jadval bo‘yicha amalga oshirish mumkin.
3-jadval
Turli o‘lchamdagi DNK molekulalarining (to‘g‘ri shaklli, kovalent-tutashgan xalqali) samarali bo‘linishi uchun ishlatiladigan geldagi agarozaning (%) miqdori
Agarozaning miqdori (%) DNK molekulalarining o‘lchami m.j.n. da
0,3 60-5
0,6 20-1
0,7 10-0,8
0,9 7-0,5
1,2 6-0,4
1,5 4-0,2
2,0 3-0,1
Bir xil kattalikdagi lekin turli konformatsion holatdagi DNK molekulalari (buralgan yopiq halqali, ochiq halqali va liniyali shakllari) agaroza gelida turli tezlikda yuradi. Ulrning qiyosi elektroforetik harakati ma'lum darajada elektroforez qo‘yish sharoitlariga buferning ion kuchiga, tok kuchiga va agarozaning miqdoriga bog‘liq. Maxsus uslullar yordamida DNK molekulalarining konformatsion holati bilan ularning geldagi joylashgan joyi orasidagi moslikni aniqlash mumkin. Ushbu amaliyotda ishlatiladigan elektroforezning standart sharoitida DNK ning kichik molekulyar og‘irlikdagi (30•106 dalьtongacha bo‘lgan) buralgan xalqasimon shakli katta bo‘lmagan tezlikda xromosoma DNK sidan oldinda yuradi, katta molekulyar og‘irlikga (30•106 dalьtondan yuqori bo‘lgan) ega bo‘lgan molekulalari esa kamroq tezlikda yuradi va gelda xromosoma DNK sidan yuqorida joylashadi.
Ishning borishi. Eletroforez apparatini yig‘ish. Agarozali gel elektro-forez gorizontal va vertikal qurilmalar yordamida olib borish mumkin. Aniq natijalar olish uchun gorizontal qurilmalar oddiy tuzilishga ega bo‘lib va ishlash uchun juda qulaydir. Qurilma organik shishadan yasalgan to‘rtburchak idish (kyuveta) bo‘lib, ikki chetida doimiy tok manbaiga ulanadigan platinali elektrodlar joylashgan nobud bo‘ladi. Kyuveta tagiga apparatga quyiladigan buferning hajmini ko‘paytirish uchun va gel bilan ishlashga qulayligi uchun organik shisha plastinka-taglik qo‘yiladi.
13-rasm. Elektroforez
Agarozali gel tayyorlash. Kerakli miqdorda agaroza tortib olinadi va kerakli miqdorda bufer eritma solinadi va agar eriguncha (suv hammomida) qaynatiladi. Agaroza batamom erib ketganidan so‘ng 50-550 S gacha sovitiladi, tezda plastinka taglikka quyiladi va chuqurchalar hosil qilish uchun taroqcha (grebenka) qo‘yiladi. Taroqchani shunday qo‘yish kerakki taroq tishlari gel quyilgan bilan plastinka tagiga 0,5-1 mm oraliq qolsin. Gel qotganidan so‘ng (30-40 daq. xona haroratida) taroqcha geldan sekin olinadi va elektroforez apparatiga joylab elektroforez buferi geldan 2-3 mm yuqorigacha to‘ldiriladi.
DNK namunalarini gelga solish. DNK namunalari antikonvektsion eritma bilan aralashtiriladi, avtomat pipetkalar (20-200 mkl) yordamida gelga ehtiyotkorlik bilan solinadi. Antikonvektsion eritma tarkibida bo‘yovchi modda (bromid fenol ko‘k-0,0025%) tutib, uning yurishiga qarab elektroforez jarayonining borishini kuzatish mumkin. Bundan tashqari yana saxaroza (40%) bo‘lib u DNK namunasining elektroforez buferi bilan aralashib ketmasligini ta'minlaydi. Odatda namuna miqdorining 1/4 - 1/5 miqdoricha antikonvektsion eritma solinadi.
Namuna solingandan so‘ng apparatning qopqog‘i yopiladi, doimiy tok manbai yoqiladi va kerakli kuchlanish qo‘yiladi (DNK gelga kirguncha 20 V so‘ngra 100-120 V).
Elektroforez odatda ko‘k bo‘yoq gel oxiriga (1-2 sm qolgunicha) yetgunicha olib boriladi. 0,5-0,7 % li agarozali gel elektroforezida kuchlanish 100-120 V bo‘lganda 2 soat davom etadi.
Gelni bo‘yash. Elektroforez tamom bo‘lganidan so‘ng qurilma tok tarmog‘idan uziladi, gelli idishcha fotografiya kyuvetasiga olinadi va bromid etidiy (0,5 mkg/ml distillangan suvda) solinadi va 40-60 daqiqa davomida bo‘yaladi. So‘ng bo‘yog‘i to‘kiladi (albatta rezina qo‘lqop bilan ishlash kerak), gel distillangan suvda chayiladi va (shisha ko‘zoynak taqqan holda) transillyuminatorda ko‘riladi (14, 15-rasmlar).
14-rasm. Gelni bo‘yash
15-rasm. Rasmi olingan gel
Zarur bo‘lgan hollarda gel rasmga olinadi. Buning uchun ochiq diafragmada sariq yoki sabzi rang filьtrlarida rasmga olinadi. Ekspozitsiya empirik tanlanadi (odatda 5-10 daq.). Gel akslanuvchi yoki o‘tuvchi ulьtrabinafsha nurlarida (254 nm) ulьtrabinafsha nuri manbai tizimiga bog‘liq ravishda yoritiladi.
Nazorat savollari:
1. Elektroforez apparatini yig‘ish usularini sanab o‘ting?
2. Gel qanday ranglarda bo‘yaladi?
3. Nima maqsadda elektroforez qilinadi?
|
