|
Nuklein kislotalarning kontsentratsiyasi va tozaligini aniqlang
|
| bet | 1/2 | | Sana | 13.09.2022 | | Hajmi | 1.21 Mb. | | #25875 |
Bog'liq GEL ELEKTOFOREZI Korrelyatsion o, Betlik, Postoperative-Surgical-Complications 2015, ASLO\'S 22-ma\'ruza, Сиртқи тест, 1-вазифа, 1-1-Mustaqil Ingliz tili 2023, 27634, Algoritmlarni loyihalash fanidan 5-amaliy ish, Ma’lumotlarni kiritish-chiqarish arxitekturasi va shinalar, Услубий қўлланма - ёрдамчи, Документ Microsoft Word, 14akushervaginek2324, C# dasturlash tilida sinflar ierarxiyasini tashkil etish-fayllar.org
Nuklein kislotalarning kontsentratsiyasi va tozaligini aniqlang
Éva Mészáros tomonidan yozilgan
24 iyun 2021 yil
Namunalardan nuklein kislotalarni tozalash molekulyar biologiya laboratoriyalarida keng tarqalgan ish jarayonidir. Biz to‘g‘ri qaror qabul qilishda yordam berish uchun laboratoriya tashkil qilish va unga asbob-uskunalar sotib olishda nimalarga e’tibor berish kerakligini tushuntirib beruvchi besh qismdan iborat turkumni jamladik. Samarali namunalar to'plash , nuklein kislotalarni olish usullari va PCR laboratoriyasini o'rnatishni muhokama qilgandan so'ng , biz nuklein kislotalarning kontsentratsiyasi, hosildorligi va tozaligini aniqlashning turli usullarini ko'rib chiqamiz.
1-qism: Samarali namuna yig'ish bo'yicha oson qo'llanma
2-qism: Nuklein kislotani olish uchun asosiy uskunalar
3-qism: noldan PCR laboratoriyasini o'rnatish
5-qism: Nuklein kislotalarni qanday tozalaysiz?
1 Agaroz gel elektroforezi
Jel elektroforezi
Jel elektroforez - bu DNK, RNK yoki oqsillar kabi molekulalarni ularning hajmi va zaryadiga qarab ajratish uchun ishlatiladigan usul. Jelning bir uchidagi quduqlarga namunalar yuklanadi va elektr toki qo'llaniladi. Molekulalar zaryadi va hajmiga qarab jel orqali tezroq yoki sekinroq harakatlanadi, bu ularni bir-biridan ajratishga imkon beradi.
GLOSSARIYGA O‘TISH
Jel elektroforezi har xil turdagi jellar bilan amalga oshirilishi mumkin, ularning har biri boshqa namuna turiga mos keladi. Nuklein kislotalar odatda agaroz gel bilan tahlil qilinadi.
1.1 U qanday ishlaydi?
Agaroz jel elektroforezi uchun siz avval agarozni - dengiz o'tlarining 1 turidan olingan tabiiy polisakkaridni o'tkazuvchan tamponda eritib, uni jel patnisiga joylashtirishga ruxsat berish orqali jelni quyasiz. Namuna quduqlarini yaratish uchun plastik taroqdan foydalaning. Jel o'rnatilgandan so'ng, patnisni o'tkazuvchan bufer eritmasi bilan to'ldirilgan jel idishiga joylashtiring yoki jel patnisiga bufer eritmasini qo'shing, nuklein kislota namunalarini yuklovchi bo'yoq bilan aralashtiring va ularni namuna quduqlariga pipetka bilan o'tkazing. Nuklein kislotalaringiz hajmini molekulyar og'irlik belgisi bilan solishtirish uchun uni birinchi quduqqa qo'shing. Keyin jelning uzunligi bo'ylab elektr maydonini qo'llang. Nuklein kislotalarning magistrallari manfiy zaryadlanganligi sababli, ular musbat zaryadlangan elektrod tomon ko'chib o'tadi va ularning hajmiga qarab ajralib chiqadi - nuklein kislotalar qanchalik katta bo'lsa, ular shunchalik sekinroq ko'chib o'tadi. Jelni ishga tushirgandan so'ng, jelni etidiy bromid kabi lyuminestsent interkalatsiya bo'yoq bilan bo'yash orqali nuklein kislotalaringizni tasavvur qiling va jel hujjatlashtirish tizimi yordamida tasvirni oling. Bo'yoqqa qarab, jelni quyishdan oldin uni qo'shishingiz kerak bo'lishi mumkin. 1
1.2 Kerakli uskunalar va bufer
Agaroz gel elektroforezini amalga oshirish uchun sizga gel elektroforez tizimi, tashqi quvvat manbai va biologik xavfsizlik shkafi kerak, chunki interkalatsiya qiluvchi bo'yoqlar xavflidir.
Agaroz gel elektroforezi uchun ikkita eng keng tarqalgan tamponlar TAE (Tris-asetat-EDTA) va TBE (Tris-borat-EDTA) hisoblanadi. Ularning orasidagi farq shundaki, TAE yirik nuklein kislota segmentlarini (>15000 bp) ajratishda yaxshiroq, TBE esa kichikroq bo'laklar uchun (<1000 bp) yaxshi mos keladi. TBE ni uzoq yoki takroriy ishlash uchun ham tanlash kerak, chunki u yaxshi buferlash qobiliyatiga ega va shuning uchun qizib ketishga kamroq moyil bo'ladi. Biroq, borat ferment inhibitori bo'lgani uchun, agar siz bantlarni qayta tiklashni va nuklein kislotalarni PCR kabi fermentni o'z ichiga olgan quyi oqim dasturlari uchun ishlatmoqchi bo'lsangiz, TAE dan foydalanishingiz kerak. Va, eng muhimi, turli buferlarni aralashtirmasligingizga ishonch hosil qiling, masalan, gelingizni quyish uchun TAE dan foydalaning va keyin laganni TBA bilan to'ldirilgan idishga joylashtiring. 2 ,3,4,5
1.3 Konsentratsiya va tozalikni qanday aniqlash mumkin
Agaroz gel elektroforezidan foydalanib, namunangizdagi nuklein kislota kontsentratsiyasini faqat nuklein kislota tasmasining intensivligini o'lcham belgisining mos keladigan bandi bilan solishtirish orqali taxminiy baholash mumkin. Agar siz, masalan, jelga suyultirilmagan DNKning 2 mkl namunasini yuklagan bo'lsangiz va sizning bandingiz bir xil uzunlikdagi 100 ng standartidagi band bilan bir xil intensivlikka ega bo'lsa, sizning namunangiz konsentratsiyasi 50 ng/ml (100 ng bo'lingan) bo'ladi. 2 mkl). 6
Namunalaringiz kontsentratsiyasining taxminiy bahosini berishdan tashqari, agaroz gel elektroforezi nuklein kislota olish protokollaridan keyin ularning tozaligini tekshirishga yordam beradi. Agar siz, masalan, genomik DNKni ajratib olgan bo'lsangiz, namunalaringiz past molekulyar og'irlikdagi smear sifatida aniqlanishi mumkin bo'lgan RNK bilan ifloslangan yoki yo'qligini aniqlash uchun jelni ishlatishingiz mumkin. 7
Jelni ishlatish PCR reaktsiyalaridan keyin ham tavsiya etiladi, chunki ular juda sezgir va ifloslanishga moyil. Salbiy va ijobiy boshqaruv elementlari kutilgan natijalarni beradimi yoki yoʻqligini tekshirish asosiy aralashmaning ifloslanishini erta aniqlashga yordam beradi va ekstraksiya protokoli, reagentlar va kuchaytirish bosqichlarining ishlashini tasdiqlaydi. Bundan tashqari, siz faqat bitta bandni olganingizni tekshirish orqali faqat qiziqishlar ketma-ketligi kuchaytirilganligini ko'rishingiz mumkin. Va agar siz o'lcham belgisidan foydalansangiz, kuchaytirilgan nuklein kislota segmentlari kutilgan o'lchamga ega ekanligini tasdiqlashingiz mumkin.
2 Spektrofotometriya
Spektrofotometriya
Spektrofotometriya namuna tomonidan so'rilgan ma'lum bir to'lqin uzunligidagi yorug'lik ulushini o'lchaydi. Absorbsiya qiymatlari namunani sifat va miqdoriy tahlil qilish imkonini beradi, masalan, eritmaning tozaligini yoki ma'lum bir tahlil qiluvchi moddaning konsentratsiyasini aniqlash.
GLOSSARIYGA O‘TISH
2.1 U qanday ishlaydi?
Spektrofotometriya yordamida nuklein kislota kontsentratsiyasi va tozaligini o'lchash uchun siz mikrospektrofotometr yoki spektrofotometr va mikrokyuvetalar bilan ishlashingiz mumkin.
Agar siz mikrospektrofotometrdan foydalanayotgan bo'lsangiz, birinchi navbatda pastki poydevorga tomchi tomchilab quyish, tayanch qo'lini yopish, qisqa vaqt kutish, qo'lni ko'tarish va tayanchlarni distillangan suv bilan tozalashingiz kerak. quruq, tuklarsiz laboratoriya ro'molcha.
Asbobni tozalagandan so'ng, siz pastki poydevorga nuklein kislotasi to'xtatilgan yoki erigan bufer tomchisini pipetka bilan urishingiz kerak. Mikrospektrofotometrning qo'lini tushirishingiz bilan suyuqlik yuqori va pastki poydevor o'rtasida ustun hosil qiladi va sirt tarangligidan ushlab turadi. Spektral o'lchovlarni amalga oshirish uchun mikrospektrofotometr ksenon chiroqdan yorug'likni yuqori poydevordan suyuqlik va pastki poydevor orqali o'tkazadi, bu erda u o'rnatilgan spektrometr tomonidan aniqlanadi.
Bufer bilan bo'sh o'lchovni bajarish buferning absorbsiya ta'sirini bartaraf etishga imkon beradi. Mikrospektrofotometrni nolga tenglashtirganingizdan so'ng siz 230 nm, 260 nm va 280 nm to'lqin uzunliklarida namunalaringizning absorbsiyasini o'lchashingiz mumkin. Qayta tiklanadigan natijalarga erishish uchun namunalaringiz bir hil va yaxshi aralashtirilgan bo'lishi kerak. Bundan tashqari, keyingisini qo'shishdan oldin har bir namunani yuqori va pastki poydevorlardan artib, poydevorlarni toza saqlashingizga ishonch hosil qiling. Har 10 ta namunadan keyin bo'sh o'lchovni bajarishni tavsiya etamiz . Agar u absorbsiyani ko'rsatmasa, keyingi 10 ta namunaga o'ting va agar absorbsiyani aniqlasangiz, pedestallarni distillangan suv bilan tozalash orqali oldingi namunalardagi qoldiqlarni olib tashlang.
Spektrofotometr bilan ishlash juda o'xshash, ammo blanka va namunalarni tomchilab quyi poydevorga tomchilab quyish o'rniga, ularni mikrokyuvetkalarga to'ldirib, siz uchun absorbsiya o'lchovlarini bajaradigan spektrofotometrga birma-bir kiritasiz.
2.2 Kerakli uskunalar
Yuqorida aytib o'tilganidek, siz mikrokyuvetalar bilan ishlaydigan spektrofotometr yoki mikrospektrofotometrdan foydalanishingiz mumkin. Spektrofotometr sezgirroq bo'lsa, mikrospektrofotometr 0,5 µl gacha bo'lgan namuna hajmlari bilan ishlashi mumkin. Ko'pgina ishlab chiqaruvchilar ikkalasini birlashtirgan qurilmalarni ham taklif qilishadi.
2.3 Konsentratsiya va tozalik qanday aniqlanadi
Spektrofotometrlar va mikrospektrofotometrlar nuklein kislota kontsentratsiyasini quyidagi formula bo'yicha hisoblaydi:
Konsentratsiya (µg/ml) = 260 ko‘rsatkich x konversiya koeffitsienti
Konversiya koeffitsienti dsDNK uchun 50 µg/ml , RNK uchun 40 µg/ml va ssDNK uchun 33 µg/ml.
Eslatma: Agar siz namunalarni o'lchashdan oldin suyultirsangiz, konsentratsiyani suyultirish koeffitsienti bilan ko'paytirish kerakligini unutmang.
Namunangiz kontsentratsiyasini bilganingizdan so'ng, uning rentabelligini quyidagicha hisoblashingiz mumkin, masalan, PCR reaktsiyangiz quyi oqim qo'llanilishi uchun etarli miqdorda nuklein kislotalar hosil qilganligini aniqlash uchun:
Hosildorlik (µg) = Konsentratsiya x umumiy namuna hajmi (ml)
Spektrofotometriyadan namunaning tozaligini aniqlash uchun ham foydalanish mumkin. Protein ifloslanishini aniqlash uchun A 260 /A 280 nisbatini (va DNK namunalarida RNK ifloslanishini) va xaotrop tuzlar, EDTA, ion bo'lmagan yuvish vositalari, oqsillar va fenol bilan ifloslanishni aniqlash uchun A 260 /A 230 nisbatini hisoblang. Sof dsDNK A 260 /A 280 nisbati 1,85-1,88 va sof RNK 2,1 atrofida. A 260 / A 230 nisbati odatda A 260 / A 280 nisbatidan yuqori va odatda dsDNK uchun 2,3-2,4 va RNK uchun 2,1-2,3 orasida yotadi. 8
O'QIYOTGAN NIMALARINGIZ SIZGA YOQDIMI? YANGILIKLARNI KUZATIB BORING, XABARDOR BO'LIB BORING; BIZ BILAN QOLING!
3 Florometriya
Florometriya
Ftorometriya - namunadagi tahlil qiluvchi moddalarni aniqlash va miqdorini aniqlash uchun ishlatiladigan usul bo'lib, namunaga qiziqqan analitga bog'laydigan ftoroforlarni qo'shish, ularni UV nurlari bilan hayajonlantirish va chiqarilgan to'lqin uzunligini aniqlash va o'lchash. Namuna floresansini ma'lum standartlarga solishtirish orqali tahlil qilinadigan moddaning miqdorini aniqlash mumkin.
GLOSSARIYGA O‘TISH
3.1 U qanday ishlaydi?
Spektrofotometriyadan farqli o'laroq, florometriya tahlilni o'rnatishni talab qiladi. Bu sizning namunangizga mos keladigan va lyuminestsent bo'yoq, bufer va standartlardan iborat bo'lgan tahlil to'plamini olishingiz kerakligini anglatadi. Namunalarni tayyorlashda floresan bo'yoq nuklein kislotalar va standartlarga bog'lanishiga ishonch hosil qilish uchun to'plam ishlab chiqaruvchisi ko'rsatmalariga amal qiling. Eng keng tarqalgan floresan bo'yoqlar haqida umumiy ma'lumotni quyidagi jadvalda topish mumkin. Pipetlash va aralashtirish bosqichlarida havo pufakchalari paydo bo'lishiga yo'l qo'ymaslik muhimligini unutmang, chunki ular keyinchalik florometr o'lchovlariga salbiy ta'sir ko'rsatishi mumkin.
|
| |
