|
Plazmid DNKsini ajratish va tozalash uslublari
|
| bet | 3/3 | | Sana | 13.09.2023 | | Hajmi | 22 Kb. | | #81515 |
Bog'liq GM 1 Amaliy mashg`ulotPlazmid DNKsini ajratish va tozalash uslublari bibliofond.ru 895828, Dilshoda 1, MUHLISA, Kurs ishi.1, 7.2.4.3 Lab - Using Wireshark to Examine FTP and TFTP Captures, «Kitob mening do‘stimsan» tadbir ssenariysi Kitob mening do‘stim, 12-Mavzu. Iqtisodiy o’sishning umumiy tavsifi. Neokeynscha va ne, Iqtisodiy o’sishning keynscha va neokeynscha modellari reja, Kurs ishi Mavzu, 13-Mavzu. Iqtisodiy о‘sishning umumiy tavsifi va neokeynscha mod, O’zbekistonning o’ziga xos istiqlol taraqqiyot yo’LI, amir temur tavalludiga bagishlangan tadbir ssenariysi www.sadikov.uz Plazmid DNKsini ajratish va tozalash uslublari
Kerakli anjomlar va reaktivlar:
1. 400 ml tungi pTi plazmidli Agrobactrium tumefacines S58 va pRi plazmidli Agrobactrium rizogenes kulturasi.
2. 10 ml STET buferi; 0,9 ml TES-buferi; 50 ml-li kolba; 1 ml lizotsim eritmasi (20mg/ml); sekundomer, 1 ml-li avtomat pipetkalar.
3. 0,65 g. agaroza, 0,5 l elektroforez buferi, 12-21V "Bekman" sentrifugasi, 18-80 M "Bekman" ultratsentrifugasi, -200c haroratli muzlatgich kamera yoki -180c haroratlili muzlatgich, 1000c haroratli suv hammomi, muz hammomi, elektroforez apparati, doimiy tok manbai, xemiskop.
Shtamm va ozuqa muhitlar: Agrobactrium tumefacines va Agrobactrium rizogenes Ri A4 shtammlari, biomassa o‘stirish uchun (agarli) Xottikler yoki LV buloni.
Ishdan maqsad - Agrobakteriyalar Ti va Ri plazmid DNKlarini ajratish.
Tajriba rejasi. Bakterial hujayralar sentrifugada cho‘ktirilib, STET -buferida suspendirlanadi. Hujayradagi xromosoma DNKsi va oqsillarni cho‘ktirish uchun suspenziyaga lizotsim solib, qaynatiladi. Sentrifugalanib, denaturatsiyaga uchragan oqsillar va xromosoma DNKsi cho‘ktiriladi. Suyuq qismiga RNKaza fermenti bilan ishlov beriladi va plazmida DNKsi etanolda cho‘ktiriladi, so‘ng TES-buferida eritiladi va agarozali gel elektoroforezda taxlil qilinidi.
Ish tartibi. Bu tajribani bajarish uchun talabalar ikkitadan birlashadi. Har bir juft bitta shtammdan DNK ajratadi. Bir kun o‘stirilgan kultura (400 ml) 3000 aylana/daq. tezlikda 30 daqiqa sentrifugalanadi. Har bir kultura cho‘kmasi 10 ml STET - buferida suspendirlanadi va 50 ml-li Erlenmeyer kolbasiga solinadi. Suspenziyaga 1 ml lizotsimning suvdagi eritmasi (20 mg/ml) qo‘shiladi va tez aralashtirib aralashma isitgichga qo‘yiladi. Birinchi qaynash alomatlari ko‘rinishi bilan kolbani, 40 sekundga qaynab turgan suv hammomiga joylanadi, so‘ng olib tezlik bilan muz hammomiga 5 daqiqaga qo‘yiladi. Hosil bo‘lgan yopishqoq (shilimshiq) lizatni sentrifuga probirkalariga teng miqdorda solinib 25000 ayl/daq. tezlikda 40S da 30 daqiqa sentrifugalanib, xromosoma DNKsi va denaturatsiyalangan oqsillardan tozalanadi. So‘ng tiniq suyuqlik shisha sentrifuga probirkalariga solinadi va 10 mg/ml miqdordagi RNKaza bilan xona haroratida 1 soat inkubatsiyalanadi. Suyuqlikka teng miqdorda izopropanol qo‘shib, muzlatgichga -200C ga 1 soat qo‘yiladi. So‘ng 3000 ay/daq, tezlikda 20 daqiqa sentrifugalanadi. Cho‘kma havoda quritiladi va 0,9 ml TES -buferida eritiladi. Shu eritmadan 20 mkl olib agarozali gelda elektroforez qo‘yiladi va plazmidning borligi tekshiriladi.
|
| |
