BLOTLAMA TEKNİKLERİNE ÖRNEK
Southern Blotlaması
DNA üzerinde bulunan özel baz dizileri uygun problar (kısa spesifik DNA parçaları) kullanıldığında görüntülenebilir veya DNA üzerindeki herhangi bir genin pozisyonu tespit edilebilir. Bu amaçla DNA molekülleri öncelikle agaroz üzerinden membranlara transfer edilmelidir. Piyasada iki tip membran kullanılmaktadır (Naylon ve Nitroselüloz). Bu membranların bazıları pozitif yükle donanmış iken bazıları nötraldirler. Pozitif yüklü membranlara DNA’nın transferi ve membran üzerine fiksasyonu nispeten kolaydır.
METOD
Jel elektroforezini takiben çifte sarmal DNA yapısını bozmak için jel 0.5 M NaOH içerisinde tutulur. Daha sonra jel nitroselüloz membran üzerine yatırılıp, membran üzerine kalın bir kağıt havlu tabakası ve uygun bir ağırlık ilave edilir. Bu yolla jel içerisindeki sıvı kapileri güç ile jel üzerinden membrane doğru akma eğilimine zorlanır. Akan sıvı ile birlikte DNA molekülleri de
membran üzerine aktarılır. Membran kurutulduktan sonra DNA molekülleri membran üzerine 80 derecede ısıtlarak veya UV ışıma ile sabitlenir. Bu noktadan sonra DNA molekülleri uygun bir DNA probu ile hibridize edilip tanımlanacak haldedir.
Northern blotlaması
Southern blotlaması ile prensipte aynı olup en önemli farkı DNA molekülleri yerine RNA moleküllerinin membran üzerine transferini içerir.
Western blotlaması
Bu blotlama metodunda proteinler PVDF veya nitroseluloz membrana transfer edilirler. Proteinlerin acrilamid jel üzerinden membrana transferi özel bir tampon içerisinde elektrik akımı verilerek yapılır. Bu sebeple western transfer işleminde özel tasarlanmış aletlere ihtiyaç vardır.
| 