Periferik kandan dna izolasyonu

Figür 2. Lökositler

Kan pulcukları (Platelets)

Plazma (Plasma)

İnsan genomik DNA’sı 3x 10⁹ nukleotid uzunluğundadır. Genomik DNA bütün nükleusu bulunan hücrelerde bulunur ve bu hücreler genomik DNA analizleri için kullanılabilir. Örneğin; prenatal tanı için amniyotik sıvıdaki fetal hücrelerden veya koryonik hücrelerde genomik DNA elde edilebilir. Erişkinlerde periferal kandaki lökositler en kolay ulaşılabilen DNA kaynağıdır. EDTA’lı tüplere alınan 10 ml kan yaklaşık olarak 10⁸ beyaz kan hücresi içerir ve bu miktar hücreden elde edilecek genomik DNA pek çok genetik test için yeterlidir. DNA izolasyonu için pek çok metod vardır. Geleneksel izolasyon yöntemlerinin yanında pek çok firma tarafından üretilen DNA izolasyon kitleri DNA izolasyonunda kullanılmaktadır. Ayrıca mRNA kullanarak sentezlenen cDNA’da bir diğer DNA kaynağıdır. DNA degredasyona karşı dayanıklı bir polimerdir ve uygun saklama şartlarında uzun yıllar korunup tekrar tekrar analizlerde kullanılabilir. Tıbbi Biyoloji laboratuarında yaygın olarak kullanılan amonyum asetat yöntemi ile DNA izolasyonu aşağıda açıklanmıştır.

1. 
   EDTA’lı tüpte bulunan 10 ml periferik kan herhangi bir kontaminasyonu önleyecek özenle 50 ml’lik falkon tüpüne aktarılarak üzerine 1:3 oranında eritrosit lizis tamponu eklenir. 4^oC’de 20 dakika bekletilip, 1500 rpm’de 10 dakika santrifüj edilir.
   
2. 
   Örnek santrifüjden alınarak üzerindeki süpernatant atılır. Pellet süspanse edilir ve üzerine 20 ml eritrosit lizis tamponu eklenir. Tekrar 1500 rpm’de 10 dakika santrifüj edilir ve süpernatan atılır.
   
3. 
   Pelet tamamen süspanse edilip üzerine 500 l SDS (’luk), 50l proteinaz K (20mg/ml) ve 9.4 ml WBL (White Blood-Cell Lysis) tamponu eklenerek 56^oC’de su banyosunda gece boyu bekletilir.
   
4. 
   İnkübasyon sonrası üzerine 3700l Amonyum asetat (9.5 M) eklenip iyice karıştırılır.20 dakika 4 ^oC ve 4500 rpm’de santrifüj edilir.
   
5. 
   Üst kısımda kalan pellet olmayan temiz sıvı kısım aktarılarak yeni bir falkon tüpe alınır, altta kalan pellet kısmı atılır. Ayrı tüpe aktarılan supernatanın üzerine -20 ^oC’de beklemekte olan ?’luk etanol’den 20 ml eklenir ve DNA’nın yüzeyde toplanması beklenir.
   
6. 
   Toplanan DNA pipet yardımıyla alınarak içersine 400l p etanol olan bir eppendorf tüpe aktarılır.
   
7. 
   Maksimum hızda (13.000 rpm) 10 dakika santrifüj edilerek DNA çöktürülür ve süpernatan atılır.
   
8. 
   Isıtıcı blokta kurutularak DNA üzerinde kalan alkol uzaklaştırılır.
   
9. 
   Elde edilen DNA’nın miktarına göre 100–300l kadar TE (Tris-EDTA) tamponu eklenir.
   
10. 
    56^oC’de 1 saat bekletilerek DNA’nın TE tampon içersinde iyice çözülmesi sağlanır.
    
11. 
    Ağızları iyice kapatılmış olan eppendorf tüpteki stok DNA’lar 4^oC’de deneylerde kullanılmak üzere ismlendirilerek muhafaza edilir.
    

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) bir in vitro ve in vivo DNA amplifikasyon metodudur, reaksiyonlar farklı sıcaklıklardaki üç olayın sikluslar halinde tekrarına dayanmaktadır. PCR ile DNA fragmentleri çoğaltılabilir ve çok küçük örneklerden analizler için yeterli miktarlar elde edilebilir.

Gerekli olan reaktifler:

1) kalıp olarak kullanılacak DNA (genomik DNA);

2) iki tane tek iplikli sentetik DNA oligonükleotidi (forward ve reverse primer), PCR yapılmak istenen gen dizisini belirler;

3) dört tip deoksiribonükleotid trifosfat (dNTPs);

4) yüksek ısıda çalışabilecek bir DNA polimeraz (Taq DNA pol.).

PCR üç ana siklusun tekrarlarından meydana gelir:

• 
  denatürasyon 94ºC’de çift iplikçikli DNA’nın iki tek iplikçiğe ayrılması;
  
• 
  annealing (eşleşme) 50-60ºC’de primerlerin tek iplikçik halindeki kalıp DNA’ya spesifik olarak bağlanmaları;
  
• 
  extension (sentez) 72ºC’de, primerlerle sınırlandırılmış olan bölgenin Taq pol. tarafından amplifikasyonu.
  

dNTP’s 2 mM

10 X Buffer (MBI) 1x

MgCl 1.50 mM

DNA 100 ng

Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analizi restriksiyon endonükleazların çift iplikli DNA’yı spesifik tanıma bölgelerinden kesmesi temeline dayanmaktadır. Endonükleazlar bakteriler tarafından bakteriyofaj infeksiyonuna karşı savunma amacıyla üretilirler. Bu enzimler bakteriyofaj DNA’sını tanıyıp parçalarken bakterinin kendi DNA’sına zarar vermezler. Her bir restriksiyon endonükleaz spesifik palendromik kısa DNA dizisini tanır ve keser. PCR ile çoğaltılan DNA bölgesi restriksiyon enziminin kesimine tabi tutulur. Oluşan DNA fragmentleri jel elektroforezi ile fragment büyüklüklerine göre ayrılırlar. DNA mutasyonları enzimin kesme noktasını ortadan kaldırabilir veya yeni bir enzim kesme noktası oluşturabilir, böylelikle kesim sonucu oluşan fragment sayısını değiştirirler. Restriksiyon bölgeleri arasındaki insersiyon veya delesyon mutasyonları da fragment büyüklüklerini değiştirirler. Genomda kodlama yapan ve yapmayan bölgelerde restriksiyon enzim tanıma bölgelerinin dağılımı insanlar arasında farklıdır. Bu farklılıklar doğal genomik çeşitliliği yansıtır ve genellikle fenotipik bir sonucu olmayan RFLP’leri oluşturur. Bunun yanında RFLP analizleri genetik hastalıkların association ve linkage çalışmalarında sıkça kullanılmaktadır. Hastalıkla ilişkilendirilen aday gendeki RFLP’ler, etkilenmiş bireyler ve kontroller arasındaki allel frekansları dikkate alınarak ilgili mutasyon ve genin hastalıkla ilişkisini ortaya koymada oldukça kullanışlı bilgi vermektedir.

Polimerizasyon sonrası camlar elektroforez cihazına yerleştirilir, 1X TBE içeren yürütme tamponu ilave edilip örnekler jel kuyucuklarına yüklenir. Yükleme tamponu içinde bulunan ve elektrik alanda hareket eden DNA brom fenol mavisi ve ksilen siyanol boyaları yardımıyla jel üzerinde takip edilir.

Genetik terminolojisinde belirli bir kromozomal lokasyondaki (locus), belirli DNA dizilerinin farklı versiyonlarına allel adı verilir ve genetikçiler polimorfik terimini, populasyonda yaygın olarak iki veya daha çok alleli bulunan bir geni tanımlamada kullanırlar. Monomorfik gen, bir populasyonda ağırlıklı tek allel olarak bulunan gendir. Bir allelin populasyondaki yaygınlığı en az ? oranında bulunuyorsa bu gen monomorfiktir. Diğer bir anlatımla, polimorfik gen iki veya daha fazla allele sahip olmalı ve bu alleller populasyonda %1’den fazla oranda bulunmalıdır. Bunlara karşılık populasyonda %1’den daha az gözlenen allele ise nadir varyantlar (rare variant) adı verilir. Bazı alleller, genler arasındaki veya intronlar içersindeki DNA dizilerindeki değişikliklerle oluşurlar, bu değişimlerin genin fonksiyonu üzerine bir etkisi yoktur, bu tip alleller sadece direkt DNA analizi ile belirlenebilirler. Kodlama yapan diziler içersindeki değişimler sonucu oluşan alleller farklı protein varyantlarının oluşumuna neden olup ciddi fenotipik bozukluklar, değişimler ortaya çıkarabilirler. Genetik hastalıklara sebebiyet veren çoğu mutasyon (hepsi değil) nadir varyantlardır ve bu alleller genetik diversitenin en belirgin formlarıdır. Doğadaki pek çok populasyonda, genlerin büyük bir yüzdesi polimorfiktir. Bununla birlikte, küçük populasyonlarda (örneğin; nesli tükenmekte olan) genetik varyasyonun çok düşük olması beklenir çünkü gen havuzu az sayıdaki bireylerden meydana gelmiştir.

SNP’ler DNA dizisindeki varyasyonlardır, genomdaki dizide meydana gelen tek nükleotidlik (A, T, G veya C) değişim sonucu meydana gelir. Örneğin bir SNP DNA dizisini AAGGCTAA’dan ATGGCTAA’ya çevirebilir. Bir varyasyonun SNP olarak kabul edilebilmesi için, populasyonda en az %1 oranında izlenebiliyor olması gerekmektedir. Her üç SNP’den ikisi sitozinin (C) timinle (T) yer değiştirmesinden oluşur. SNP’ler bir genin hem kodlama yapan hem de kodlama yapmayan bölgesinde bulunabilir. Pek çok SNP’nin hücresel fonksiyon üzerine bir etkisi yok iken, bir kısmının hastalıklarda etkisi olduğu gösterilmektedir. İnsan DNA dizisinin ?’dan daha fazlasının aynı populasyonda aynı olmasına rağmen, DNA dizilerindeki varyasyonların insanların hastalıklar, virus, bakteri, toksinler, kimyasallar gibi çevresel faktörlere, ilaçlara ve diğer terapilere nasıl cevap vereceği üzerine önemli etkileri vardır. Bunlar da SNP’lerin çalışılmasını biyomedikal araştırmalar veya tıbbi teşhisler açısından çok değerli yapmaktadır. SNP haritalarının, kanser, diyabet, vaskular hastalıklar, nörodejeneratif hastalıklar ve zekâ bozuklukları gibi pek çok karmaşık hastalıkla ilişkili genlerin belirlenmesine yardımcı olacaktır. SNP’ler evrimsel olarak mikrosatellit markerlarına göre daha stabildirler, daha düşük mutasyon oranına sahiptirler. Bir generasyondan diğerine değişimleri az olduğundan populasyon çalışmalarında kullanılmaları daha kolay ve bilgilendiricidir. Bunun yanında SNP’lerin sayılarının fazla oluşu hastalık ve allel korelasyonunun kurulmasında şans ve avantaj doğurmaktadır.

- PCR ürünü formamid yükleme tamponu ile karıştırılıp 95C’de 5 dk denatüre edildikten hemen sonra buz üzerine alınarak soğutulur.

- Denatüre haldeki PCR ürünleri vakit kaybetmeden poliakrilamid non-denatüre jele yüklenir.

- Tek zincirli ürünler elektroforez ile birbirinden ayrılır.

- Tek zincirli DNA’nın elektroforezdeki hareketi yapısal konformasyonuna bağlıdır. Tek bazlık fark bile konformasyonunu değiştirir ve elektroforezdeki hareketinde farklılık yaratır.

- Elektroforez sonucunda jel gümüş nitrat boyası ile boyanır.

Elektroforez deneyleri tampon çözeltileri içerisinde yapılır. Bunun iki temel nedeni vardır. Birinci neden akımın geçişini sağlamak için ortamın elektrolit miktarını artırmak ikinci nedense ortamın pH’ında meydana gelebilecek radikal değişimlere izin vermemektir.

Elektroforez deneylerinde elektrik alan üç farklı şekilde oluşturulabilinir. En sık kullanılan metod da (DNA, RNA elektroforezinde) ortama verilen voltaj sabitlenerek akımın (amper) ve gücün (watt) değişimine izin verilir. [Amper X Volt = Watt]. Protein elektroforezinde ise tercih edilen akımın sabitlenip voltun ve gücün değişimine izin verilmesidir. Yüksek derecede akım ve voltaj gerektiren deneylerde ise güç sabitlenip akım ve voltajın değişimine izin verilir. Bu işlevi gerçekleştirecek aletler piyasada bulunmaktadır.



AGAROZ JEL ELECTROFOREZİ

Agaroz

Agaroz lineer bir polimer olup D-galaktoz ile L-galaktoz molekullerinin ardı sıra glikosidik bağlarla birleşmesi sonucu oluşmuştur. Agaroz zincirleri helix ikincil yapıları sayesinde çapları 20 ile 30 nm arasında değişen superkoyıllar oluştururlar. Bu superkoyıllar jelatin şeklindeki yapılara dönüşerek 50 nm ile 200 nm arasında boşluklar ihtiva eden polimere dönüşürler. Piyasada satılan agaroz polimerlerinin yaklaşık 880 adet galaktozdan oluştuğu bilinmektedir. Ancak agaroz saf bir madde değildir. İçerisinde başka polisakkaritler de ihtiva eder. Düşük kalitede bir agaroz içerisinde değişik tuzlar ve iyonları da bulmak mümkündür. Agaroz içerisindeki bu safsızlıklar agarozun erime sıcaklığını ve DNA moleküllerini ayırma kapasitesini etkiler. Bu problemler nedeni ile moleküler biyoloji deneylerinde özel hazırlanmış agaroz kullanılır.

1. 
   DNA nın moleküler büyüklüğü: Çift zincirli DNA molekülleri jel matriksleri üzerlerinde taşıdıkları baz çifti sayısına ters orantılı olarak yürürler. Büyük moleküller yavaş küçük moleküller ise hızlı bir şekilde ilerlerler.
   
2. 
   Agaroz konsantrasyonu: Lineer bir DNA molekülü farklı konsantrasyonlardaki agaroz jelleri üzerinde farklı hızlarda ilerlerler. DNA moleküllerinin jel üzerindeki elektroforetik mobilitesi ile jel konsantrasyonu arasında logaritmik bir ilişkiden bahsetmek mümkündür.
   
3. 
   DNA’nın konformasyonu: Superhelix DNA, nick olmuş DNA ve lineer DNA molekülleri agaroz jel üzerinde farklı hızlarda hareket ederler. Her bir DNA formunun jel üzerindeki migrasyonu jel konsantrasyonuna ve kullanılan agarozun saflık derecesine bağlıdır. Bunun yanı sıra kullanılan voltajın miktarı, kullanılan tampon çözeltinin iyonic gücü ve DNA formlarının yoğunluğu önemlidir. DNA’nın farklı formlarını ayırt etmenin en güzel yolu izole edilen DNA molekülü ile restriksiyon endonüklazları ile kesilmiş DNA molekülünü jel üzerinde yan yana yürütmektir.
   
4. 
   Jel içerisinde etidium bromür olup olmayışı: Etidium bromür DNA üzerindeki negatif yük miktarını azalttığı için DNA’nın ilerleme hızını % 15 yavaşlatır.
   
5. 
   Uygulanan Voltaj: Düşük voltajda DNA’nın yer değiştirme hızı düşük olacaktır. Ancak yüksek voltajda DNA moleküllerinin jel üzerindeki çözünürlülüğü azalır. Bu nedenle yüksek çözünürlük istendiğinde düşük voltaj kullanmakta fayda vardır.
   
6. 
   Agaroz tipi: İki tip agarozdan bahsetmek mümkün; Satandart agaroz ve low-melting agaroz. Low-melting agaroz standart agaroza göre daha yumuşak bir materyal olup 55 derecede sıvılaştırılabilir. Bu özelliğinden dolayı genomik klonlama deneylerinde zaman zaman kullanılır.
   
7. 
   Elektroforez tamponu: DNA’nın jel üzerindeki hareketliliği jelin içerisinde bulunduğu elektroforez tamponunun iyonik gücüne de bağlıdır. İyonların olmadığı bir ortamda elektrik akımı olmayacağından DNA molekülleri jel içerisinde yavaş ilerleyecektir. Eğer yüksek iyon gücü içeren bir tampon çözelti kullanılırsa jel aşırı ısınmadan dolayı eriyecektir.
   

1. 
   Plastik jel yürütücüsünün kenarları uygun bir şekilde kapatılır.
   
2. 
   Yeterli miktarda elektroforez çözeltisi hazırlanır. (1x TAE veya 0.5x TBE)
   
3. 
   Gerekli miktarda agaroz tartılır. Mesela %1 lik 50 ml bir agaroz çözeltisi için 0.5 gr agaroz tartmak gerekir. Tartılan agaroz üzerine tampon eklendikten sonra agaroz mikrodalga fırında veya sıcak bir elektrikli ısıtıcı üzerinde eriyene kadar muamele edilir.
   
4. 
   Sıvı hale dönüşmüş agaroz çözeltisinin sıcaklığı elle dokunulabilecek seviyeye geldiğinde (isteğe bağlı olarak agaroz çözelti içerisine etidium bromid eklenebilinir veya jel yürütüldükten sonra etidium bromid ile boyanabilir) çözelti polimerize olmadan plastik yürütme kabı içerisine dökülür ve oda sıcaklığında veya 4 derecede en az 30 dk bırakılır. Jel üzerinde kuyucukların oluşması için gerekli olan tarağın jel polimerize olmadan yürütme sistemi üzerine konulması gereklidir.
   
5. 
   Agaroz donduktan sonra tarak dikkatli bir şekilde jel üzerinden kaldırılır ve jel yürütme tankına yerleştirilir.
   
6. 
   DNA örnekleri yükleme tamponu ile karıştırıldıktan sonra her bir DNA örneği bir kuyucuğa gelecek biçimde yükleme yapılır ve sisteme akım verilerek DNA molekülleri mobilize edilir.
   

1. 
   Etidium Bromid ile
   

2. 
   SYBR gold ile
   

SYBR gold simetrik olmayan bi siyonid boyasıdır. Hem tek zincirli hem de çift zincirli DNA moleküllerini boyamada kullanılır. EtBr’e oranla çok daha duyarlı olan bu boya ile 20 pikogramdan daha az DNA miktarını gözlemek mümkündür.

Tıp II restriksiyon enzimleri DNA üzerinde palandromik DNA dizilerini tanırlar. Palandromik bir dizi her iki yönden okunduğunda aynı baz sıralamasını verir. Tıp II restriksiyon enzimleri DNA’yı kestikten sonra DNA üzerinde oluşan uçlar çoğu zaman yapışkan (stiky) uçlardır. Ancak bazı restriksiyon enzimleri yapışkan uçlar yerine kör (blunt) uçlar oluştururlar.

1.0 mikrolitre MboII tampon çözeltisi

0.5 mikrolitre Mbo II enzimi

5.5 mikrolitre dd. Su

Karışımı 37 derecede 15 dakika inkube edildikten sonra agaroz jel üzerinde yürütülerek analiz edilir.

BLOTLAMA TEKNİKLERİNE ÖRNEK
Southern Blotlaması

DNA üzerinde bulunan özel baz dizileri uygun problar (kısa spesifik DNA parçaları) kullanıldığında görüntülenebilir veya DNA üzerindeki herhangi bir genin pozisyonu tespit edilebilir. Bu amaçla DNA molekülleri öncelikle agaroz üzerinden membranlara transfer edilmelidir. Piyasada iki tip membran kullanılmaktadır (Naylon ve Nitroselüloz). Bu membranların bazıları pozitif yükle donanmış iken bazıları nötraldirler. Pozitif yüklü membranlara DNA’nın transferi ve membran üzerine fiksasyonu nispeten kolaydır.

Jel elektroforezini takiben çifte sarmal DNA yapısını bozmak için jel 0.5 M NaOH içerisinde tutulur. Daha sonra jel nitroselüloz membran üzerine yatırılıp, membran üzerine kalın bir kağıt havlu tabakası ve uygun bir ağırlık ilave edilir. Bu yolla jel içerisindeki sıvı kapileri güç ile jel üzerinden membrane doğru akma eğilimine zorlanır. Akan sıvı ile birlikte DNA molekülleri de

membran üzerine aktarılır. Membran kurutulduktan sonra DNA molekülleri membran üzerine 80 derecede ısıtlarak veya UV ışıma ile sabitlenir. Bu noktadan sonra DNA molekülleri uygun bir DNA probu ile hibridize edilip tanımlanacak haldedir.

Southern blotlaması ile prensipte aynı olup en önemli farkı DNA molekülleri yerine RNA moleküllerinin membran üzerine transferini içerir.

Bu blotlama metodunda proteinler PVDF veya nitroseluloz membrana transfer edilirler. Proteinlerin acrilamid jel üzerinden membrana transferi özel bir tampon içerisinde elektrik akımı verilerek yapılır. Bu sebeple western transfer işleminde özel tasarlanmış aletlere ihtiyaç vardır.