İçeriği
|
%
|
Su
|
~92
|
Proteinler
|
6–8
|
Tuzlar
|
0.8
|
Lipidler
|
0.6
|
Glukoz (kan şekeri)
|
0.1
|
DNA İZOLASYONU
İnsan genomik DNA’sı 3x 109 nukleotid uzunluğundadır. Genomik DNA bütün nükleusu bulunan hücrelerde bulunur ve bu hücreler genomik DNA analizleri için kullanılabilir. Örneğin; prenatal tanı için amniyotik sıvıdaki fetal hücrelerden veya koryonik hücrelerde genomik DNA elde edilebilir. Erişkinlerde periferal kandaki lökositler en kolay ulaşılabilen DNA kaynağıdır. EDTA’lı tüplere alınan 10 ml kan yaklaşık olarak 108 beyaz kan hücresi içerir ve bu miktar hücreden elde edilecek genomik DNA pek çok genetik test için yeterlidir. DNA izolasyonu için pek çok metod vardır. Geleneksel izolasyon yöntemlerinin yanında pek çok firma tarafından üretilen DNA izolasyon kitleri DNA izolasyonunda kullanılmaktadır. Ayrıca mRNA kullanarak sentezlenen cDNA’da bir diğer DNA kaynağıdır. DNA degredasyona karşı dayanıklı bir polimerdir ve uygun saklama şartlarında uzun yıllar korunup tekrar tekrar analizlerde kullanılabilir. Tıbbi Biyoloji laboratuarında yaygın olarak kullanılan amonyum asetat yöntemi ile DNA izolasyonu aşağıda açıklanmıştır.
-
EDTA’lı tüpte bulunan 10 ml periferik kan herhangi bir kontaminasyonu önleyecek özenle 50 ml’lik falkon tüpüne aktarılarak üzerine 1:3 oranında eritrosit lizis tamponu eklenir. +4oC’de 20 dakika bekletilip, 1500 rpm’de 10 dakika santrifüj edilir.
-
Örnek santrifüjden alınarak üzerindeki süpernatant atılır. Pellet süspanse edilir ve üzerine 20 ml eritrosit lizis tamponu eklenir. Tekrar 1500 rpm’de 10 dakika santrifüj edilir ve süpernatan atılır.
-
Pelet tamamen süspanse edilip üzerine 500 l SDS (%10’luk), 50l proteinaz K (20mg/ml) ve 9.4 ml WBL (White Blood-Cell Lysis) tamponu eklenerek 56oC’de su banyosunda gece boyu bekletilir.
-
İnkübasyon sonrası üzerine 3700l Amonyum asetat (9.5 M) eklenip iyice karıştırılır.20 dakika +4 oC ve 4500 rpm’de santrifüj edilir.
-
Üst kısımda kalan pellet olmayan temiz sıvı kısım aktarılarak yeni bir falkon tüpe alınır, altta kalan pellet kısmı atılır. Ayrı tüpe aktarılan supernatanın üzerine -20 oC’de beklemekte olan %99’luk etanol’den 20 ml eklenir ve DNA’nın yüzeyde toplanması beklenir.
-
Toplanan DNA pipet yardımıyla alınarak içersine 400l %70 etanol olan bir eppendorf tüpe aktarılır.
-
Maksimum hızda (13.000 rpm) 10 dakika santrifüj edilerek DNA çöktürülür ve süpernatan atılır.
-
Isıtıcı blokta kurutularak DNA üzerinde kalan alkol uzaklaştırılır.
-
Elde edilen DNA’nın miktarına göre 100–300l kadar TE (Tris-EDTA) tamponu eklenir.
-
56oC’de 1 saat bekletilerek DNA’nın TE tampon içersinde iyice çözülmesi sağlanır.
-
Ağızları iyice kapatılmış olan eppendorf tüpteki stok DNA’lar +4oC’de deneylerde kullanılmak üzere ismlendirilerek muhafaza edilir.
PCR
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) bir in vitro ve in vivo DNA amplifikasyon metodudur, reaksiyonlar farklı sıcaklıklardaki üç olayın sikluslar halinde tekrarına dayanmaktadır. PCR ile DNA fragmentleri çoğaltılabilir ve çok küçük örneklerden analizler için yeterli miktarlar elde edilebilir.
Gerekli olan reaktifler:
1) kalıp olarak kullanılacak DNA (genomik DNA);
2) iki tane tek iplikli sentetik DNA oligonükleotidi (forward ve reverse primer), PCR yapılmak istenen gen dizisini belirler;
3) dört tip deoksiribonükleotid trifosfat (dNTPs);
4) yüksek ısıda çalışabilecek bir DNA polimeraz (Taq DNA pol.).
PCR üç ana siklusun tekrarlarından meydana gelir:
| 