Hybridomy a monoklonální protilátky
Kohler a Milstein (1975) - fúzovali normální plasmatické buňky s myelomovými buňkami a získali hybridní buňky (hybridomy), které získaly nesmrtelnost od myelomových buněk a schopnost produkovat Ab od plasmatických buněk.
Fúze dvou buněk lze dosáhnout působením viru Sendai nebo častěji polyetylénglykolu, agens, která podporují fúzi buněčných membrán (obr. 11). Vznikne mnohojaderný heterokaryon, jehož jaderné membrány postupně splynou a jedno velké jádro obsahuje chromozomy obou rodičů. Běhen dělení této hybridní buňky dochází k náhodným ztrátám chromozomů, dokud se buňka nestabilizuje. Pokud dojde ke ztrátě chromozomu potřebného pro přežití, buňka hyne. Hybridomy z myších a lidských buněk postupně ztratí všechny lidské chromozomy. K selekci hybridomových buněk na úkor rodičovských se používá selektivní medium obsahující hypoxantin, aminopterin a thymidin (HAT). Savčí buňky mají dvě dráhy pro syntézu nukleotidů - hlavní a náhradní. Když je hlavní dráha blokována aminopterinem, analogem kyseliny listové, buňky využívají náhradní dráhu katalyzovanou enzymy hypoxantin-guanin fosforibozyl transferázou (HGPRT) a thymidin kinázou. Mutace v kterémkoli z těchto enzymů blokuje tuto náhradní dráhu. HAT medium obsahuje aminopterin k zablokování hlavní dráhy a hypoxantin a thymidin pro náhradní dráhu. Pokud jsou k fúzi použity myelomové buňky s mutací v HGPRT, v HAT mediu rostou pouze hybridomové buňky, protože využívají náhradní dráhu získanou od B lymfocytů. Samotné lymfocyty pouze přežívají nekolik dnů, in vitro se nedělí.
Produkce monoklonálních protilátek:
Skládá se ze tří základních kroků: (1) konstrukce B hybridomů, (2) testování získaných klonů na produkci protilátky požadované specifity a (3) pomnožení vybraných hybridomů.
Zfúzované buňky se nasazují do jamek mikrotitračních panelů s tzv. feeder buňkami, což jsou nejčastěji peritoneální makrofágy nebo thymocyty. Po 5-10 dnech růstu v HAT mediu jsou viditelné kolonie hybridomových buněk, každá představuje klonální expanzi jedné hybridomové buňky.
K testování hybridomů na produkci požadovaných Ab se nejčastěji užívá technik jako je ELISA (obr. 12) a RIA, které umožňují současné vyšetření velkého počtu vzorků. Úspěšně bývá využita i imunofluorescence.
Pozitivní hybridomy se dále klonují metodou limitního ředění, kdy se buňky naředí tak, aby na jednu jamku mikropanelu připadla asi jedna buňka. Získají se tak klony buněk představující potomstvo jedné buňky a produkující monoklonální protilátky.
Monoklonální protilátky (MAbs) mohou být pak produkovány in vitro kultivací hybridomových buněk v mediu (výtěžek MAbs 10-100 mg/ml), nebo v peritoneu syngenních myší jako ascitické tekutiny (výtěžek MAbs 1-25 mg/ml). MAbs se z ascitickí tekutiny purifikují chromatografií.
Produkce lidských monoklonálních protilátek:
Problémem užití myších MAbs u lidí je antiizotypová reakce, která může vést až k alergickým komplikacím. Problémy se získáním lidských MAbs spočívají v imunizaci (pouze in vitro) a absenci vhodných myelomových buněk.
Alternativní cesta je přes infekci B buněk virem Epsteina a Barrové, čímž tyto buňky získají vlastnosti nádorových buněk a přitom sekretují požadovanou protilátku. Klonováním těchto transformovaných buněk je možno získat lidské MAbs.
Použití monoklonálních protilátek:
Purifikace proteinů:
Místo opakovaných chromatografií s nízkým výtěžkem je možno využít imunosorbentů, kde je MAb navázána na nějaký nosič (sefarózové kuličky) a specificky vychytává antigen ze směsi. Použití takové imunosorbentní kolony k vyčištění hrubého preparátu interferonu vedlo k 5000násobnému zvýšení čistoty.
Identifikace a izolace lymfocytárních subpopulací a klonů:
Protože subpopulace lymfocytů nebo jejich různá diferenciační stadia nesou na povrchu charakteristické antigeny, mohou být MAbs využity k jejich rozlišení (např. separace CD4+ a CD8+ buněk pomocí FACS). Určitá subpopulace může být ze směsi odstraněna působením MAb a komplementu. Klonotypické MAbs rozpoznávají membránové proteiny jedinečné pro určitý lymfocytární klon.
Identifikace nádorových buněk:
Nádorové buňky nesou specifické antigeny, které je odlišují od netransformovaných buněk. MAbs proti těmto antigenům umožňují detekci tumorů, např. metastáz ve velmi časném stadiu. Problémem je však to, že řada tumorů nenese společný specifický antigen.
Likvidace nádorových buněk:
MAbs společně s komplementem mohou zabíjet nádorové buňky. Pomocí velkých dávek specifických MAbs se podařilo vyléčit pacienta s metastázovaným B lymfomem. V případě, že jsou nádorové buňky rezistentní k lýze zprostředkované komplementem, nádorově specifická MAb se konjuguje s radioizotopem nebo toxinem a vzniklý imunotoxin je může rozpoznat a zabít (obr. 13). Užívají se ricin, Shigella toxin a difterický toxin. Každý z těchto toxinů sestává ze dvou nebo více polypeptidových komponent - ze samotného toxinu a ligandy, která se váže na buněčný receptor. Tento vazebný polypeptid je u imunotoxinu zaměněn za protilátkovou molekulu specificky rozpoznávající nádorovou buňku.
Diagnostické reagencie:
Existují stovky MAbs usnadňujících diagnostiku infekčních chorob, monitorování terapeutických léků, detekci diabetu, tumorových buněk, průkaz těhotenství, mapování HLA antigenů atd.
| 