Přednáška IV
Interakce antigenu s protilátkou
Síla vazby antigen-protilátka:
Mezi antigenem (Ag) a protilátkou (Ab) se uplatňují nekovalentní vazby zahrnující: vodíkové můstky, iontové vazby, hydrofobní vazby a van der Waalsovy síly (obr. 1). Protože jsou tyto vazby slabé, silná interakce Ag-Ab vyžaduje velké množství těchto vazeb. Kromě toho každá z těchto vazeb funguje na velmi malou vzdálenost (méně než 1A = 10-7 mm), takže silná vazba je podmíněna vysokou komplementaritou mezi Ag a Ab, s čímž souvisí vysoká specifita Ag-Ab interakce.
Protilátková afinita:
Suma jednotlivých nekovalentních interakcí mezi paratopem a epitopem je rovná afinitě protilátky pro daný epitop. Protilátky s nízkou afinitou slabě váží Ag a snadno disociují, zatím co Ab s vysokou afinitou váží Ag silněji a déle. Vazba mezi paratopem a epitopem na monovalentním Ag může být popsána rovnicí
k1
Ag + Ab Ag-Ab
k-1
kde k1 je asociační rychlostní konstanta a k-1 je disociační rychlostní konstanta. Poměr k1/k-1 je asociační konstanta K, která je měřítkem afinity. Je možno ji spočítat z poměru koncentrací komplexu Ag-Ab ke koncentraci nenavázaného Ag a Ab
k1 (Ab-Ag)
K = __ = _______
k-1 (Ab)(Ag)
Ab s nízkou afinitou pro Ag mají hodnoty K mezi 104 - 105 l/mol, vysoce afinní Ab mohou mít hodnotu K až 1011 l/mol.
Hodnota K se může stanovit pomocí rovnovážné dialýzy (obr. 2). Dialyzační komůrka se rozdělí semipermeabilní membránou, která propustí pouze Ag, nikoli Ab. Do jedné části komůrky se dá Ab, do druhé Ag. Ag se radioaktivně označí a po ustavení rovnováhy se měří koncentrace Ag v obou částech komůrky. Koncentrace volného Ag v obou částech je stejná, v části s Ab je navíc Ag navázaný na Ab. Rozdíl v koncentraci Ag v obou částech komůrky vyjadřuje koncentraci Ag vázaného na Ab. Čím vyšší je afinita Ab, tím více Ag je vázáno na Ab. Rovnovážná rovnice se může přepsat do tvaru
(Ab-Ag) r
K = _______ = _______
(Ab)(Ag) (n-r)(c)
kde r = poměr koncentrace vázaného Ag k celkové koncentraci Ab, c = koncentrace volného Ag a n = počet vazebných míst v jedné Ab molekule. Výraz může být přepsán do Scatchardovy rovnice
r
_ = Kn - Kr
c
Hodnoty r a c mohou být získány opakovanou rovnovážnou dialýzou se stejnou koncentrací Ab a různými koncentracemi Ag. Když se pak vynese r/c proti r, směrnice získané přímky je rovna -K. Toto platí pro monoklonální protilátku. V případě polyklonálních Ab s různou afinitou je možno vypočítat průměrnou afinitu.
Protilátková avidita:
Když je komplexní Ag nesoucí mnoho epitopů smíchán s protilátkami nesoucími mnoho paratopů, interakce Ab s Ag na jednom místě zvýší pravděpodobnost reakce na dalším místě. Síla takovéto vazby mezi multivalentní protilátkou a antigenem je nazývána avidita. Avidita je používána pro polyklonální antiséra na rozdíl od monoklonálních protilátek. Výsledná avidita séra je mnohem vyšší než pouhý součet afinit jednotlivých protilátek v séru a rovná se jejich součinu.
Skřížená reaktivita:
Potilátka vyvolaná jedním Ag může skříženě reagovat s odlišným Ag. K takovéto skřížené reakci dojde, jestliže odlišné antigeny nesou společný epitop, nebo jestliže se protilátky, specifické pro jeden epitop, vážou na jiný epitop mající podobné chemické vlastnosti. V tomto případě je vazebná afinita Ab pro původní Ag vyšší než pro tento skříženě reagující epitop. Skřížená reaktivita se často vyskytuje mezi polysacharidovými antigeny, které obsahují podobné oligosacharidové zbytky.
Krevně skupinové antigeny (ABO) jsou glykoproteiny exprimované na červených krvinkách. Jedinec, kterému chybí některý z těchto Ag má protilátky proti tomuto chybějícímu Ag. Jedinec s krevní skupinou A má Ab proti B a naopak. Tyto Ab jsou výsledkem expozice skříženě reagujícím antigenům pocházejícím z bakterií běžně se vyskytujících ve střevech.
Řada virů a bakterií má antigenní determinanty identické nebo podobné s epitopy hostitelských buněk. Tyto Ag mohou vyvolat autoimunitní Ab odpověď poškozující vlastní tkáně. Např. Streptococcus pyogenes obsahuje ve své buněčné stěně proteinové M antigeny, které mohou skříženě reagovat s antigeny srdečního svalu a dalších kosterních svalů a způsobovat poškození srdečního svalu a ledvin. Skřížená reaktivita mezi kravskými neštovicemi a variolou umožnila vakcinaci proti variole.
Precipitační reakce (obr. 4):
Interakce mezi Ab a rozpustným Ag vytváří síť, která je stabilizována hydrofobními silami, což činí Ab-Ag komplex nerozpustným. Protilátka musí být bivalentní, Ag musí nést dvě nebo více kopií téhož epitopu. Např myoglobin je dobře precipitován polyklonálními séry ale ne monoklonální protilátkou protože obsahuje mnoho odlišných Ag determinant pouze s jednou kopií každé determinanty.
Precipitace v roztoku:
Kvantitativní precipitační reakce se provádí ve zkumavkách do kterých se přidá konstantní množství Ab a vzrůstající množství Ag. Precipitát se odcentrifuguje a jeho množství se změří. Vynesením množství precipitátu proti zvyšující se koncentraci Ag se získá precipitační křivka, která má vzestupnou část, sestupnou část a zónu ekvivalence, kdy je optimální poměr Ab:Ag. V zóně nadbytku Ab se tvoří malé rozpustné komplexy tvořené několika molekulami Ab vázajícími jednu molekulu Ag. V oblasti nadbytku Ag se váže jedna nebo dvě molekuly Ag k jedné molekule Ab a síť se netvoří. Tato metoda se někdy používá ve formě prstencového testu, kde se antisérum v malé zkumavce převrství antigenem. Ag i Ab difundují proti sobě a v zóně ekvivalence se vytvoří prstencový precipitát.
Precipitační reakce v gelech:
Ag a Ab difundují proti sobě v agaru a v zóně ekvivalence se vytvoří viditelný precipitát. Imunodifuzní technikou, kdy Ag difunduje z jamky do agaru obsahujícím protilátku, je možno určit neznámou koncentraci antigenu ze standardní křivky získané vynesením průměrů precipitačních kroužků proti log příslušných koncentrací antigenu. Metoda se nazývá Manciniho jednoduchá radiální imunodifuse a rutinně se používá ke kvantifikaci jednotlivých tříd sérových imunoglobulinů, nebo složek komplementu. Citlivost metody je 5-10 mg/ml.
V Ouchterlonyho metodě dvojité imunodifuse (obr. 5) Ag i Ab difundují proti sobě z jamek vyříznutých v agaru a vytvářejí koncentrační gradient. Tato jednoduchá technika umožňuje zjistit vztah mezi antigeny i to, kolik Ab-Ag systémů je přítomno. Pokud se dva Ag umístí do sousedních jamek a jsou testovány proti jednomu séru, získané precipitační linie umožní zjistit, zda tyto Ag sdílejí společný epitop (linie částečné identity), jsou identické (linie identity) nebo zcela odlišné (linie nonidentity).
Imunoelektroforéza (imunoelfo obr. 6) kombinuje elektroforetickou separaci s dvojitou imunodifuzí. Směs antigenů je rozdělena elektroforézou v agaru, pak jsou v agaru ve směru elektrického pole vyříznuty žlábky, které jsou naplněny antisérem. Antigeny a protilátky difundují proti sobě a vytvářejí precipitační linie. Imunoelfo je užívána v laboratořích k detekci přítomnosti jednotlivých proteinů v séru (imunodeficience). Je to pouze kvalitativní technika.
Raketová elektroforéza (obr. 7) umožňuje i kvantifikaci antigenu až do koncentrace 20 ug/ml. Negativně nabitý Ag elektroforeticky migruje v gelu obsahujícím Ab. Precipitát má tvar rakety, jejíž výška odpovídá koncentraci Ag. Modifikace raketové elfo nazvaná dvousměrná imunoelektroforéza, umožňuje kvantifikovat několik antigenů ve směsi.
Aglutinační reakce:
Interakce mezi protilátkou a partikulárním antigenem vede ke vzniku viditelných shluků - k aglutinaci. Nadbytek Ab inhibuje aglutinační reakci (efekt prozóny).
Hemaglutinační reakce je rutinně prováděna při stanovení krevních skupin. Při neutrálním pH jsou erytrocyty obklopeny negativním iontovým mrakem, takže se navzájem odpuzují (odpudivé síly se nazývají zeta potenciál). IgM může překonat zeta potenciál a vyvolat hemaglutinaci. IgG je mnohem méně efektivní. Hemaglutinace se používá i při stanovení Rh fenotypu.
Produkce sérových Ab při bakteriální infekci se využívá při bakteriální aglutinaci. Aglutinační titr je definován jako recipoká hodnota nejvyššího ředění séra, které ještě vyvolá aglutinaci. Aglutinační rekce slouží nejen při diagnostice bakteriálních infekcí, ale i k serotypizaci bakterií.
Pasivní hemaglutinace je založena na navázání antigenů na červené krvinky a jejich aglutinaci antisérem proti tomuto Ag. K navazování Ag se užívá taninová kyselina nebo chlorid chromitý. Pasivní hemaglutinace je daleko citlivější než precipitační reakce a může detegovat Ab ještě v koncentraci 0,001 mg/ml.
Inhibice aglutinace je velmi citlivá metoda, umožňující detekci malých množství antigenu. Ag je navázán např. na latexové partikule a v testu je přítomná protilátka proti tomuto Ag, která aglutinuje. Přítomnost totožného Ag ve zkoumaném vzorku inhibuje aglutinaci, protože tento Ag obsadí vazebná místa Ab. Tento test se používá i k průkazu užívání drog (kokain, heroin). Některé viry spontánně hemaglutinují a proto inhibice hemaglutinace sérovými protilátkami může být využita k diagnostice (zarděnky, chřipka).
Radioimunoassay (RIA obr. 8):
RIA je vysoce citlivá technika schopná prokázat pikogramy (10-12g) antigenu nebo protilátky. Rosalyn Yalow dostala za vývoj této techniky v roce 1977 Nobelovu cenu. Principem je soutěžení mezi radioaktivně značeným Ag a neznačenýn Ag o vazbu s vysoce afinní Ab. Značí se obvykle 125I (gama zářič) a značený Ag je smíchán s Ab v takové koncentraci, že právě saturuje vazebná místa na Ab molekule. Přidání neznačeného Ag vede k vytěsnění značeného Ag z vazby na Ab, které je úměrné koncentraci neznačeného Ag. Měření uvolněného značeného Ag umožňuje určit koncentraci neznačeného Ag. Protilátka s navázaným Ag je vyprecipitována z roztoku anti-izotypovým sérem nebo proteinem A ze Staphylococcus aureus. Některé metody využívají navázání Ab na pevnou fázi, což mohou být sefarózové kuličky nebo mikrotitrační destička. Tato metoda byla použita např. k detekci viru sérové hepatitidy B, což mělo velký význam pro vyřazení infikovaných dárců krve.
Imunoenzymatická metoda:
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) je založena na podobném principu jako RIA a má srovnatelnou citlivost. Místo značení radioizotopem se užívá navázání enzymu na protilátku. Reakce enzymu s bezbarvým substrátem vede k barevnému produktu, jehož množství lze spektrofotometricky měřit. Používají se enzymy peroxidáza, alkalická fosfatáza a další. Existují různé typy ELISA testů, kdy je na destičku navázán Ag nebo Ab a které se liší počtem dalších vrstev. Nepřímá ELISA s vrstvami Ag, sérová Ab, antiizotypová Ab značená peroxidázou se užívá k průkazu sérových protilátek proti HIV.
Western blotting (obr. 9):
Slouží k identifikaci specifického proteinu ve směsi proteinů, nebo protilátky k danému proteinu. V této metodě jsou proteiny elektroforeticky separovány v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsulfátu sodného. Proteinové proužky jsou elektroforeticky přeneseny na nitrocelulózovou membránu a jednotlivé proteiny jsou identifikovány protilátkou značenou izotopem nebo enzymem.
Imunofluorescence:
Vazba Ab na Ag je vizualizavána označením protilátky fluorochromem. Nejčastěji užívanými fluorochromy jsou fluorescein a rhodamin. Oba mohou být konjugovány s Fc oblastí protilátkové molekuly aniž dojde k poškození antigen-vazebné kapacity. Tyto fluorochromy absorbují světlo určité vlnové délky a emitují světlo o vyšší vlnové délce. Např fluorescein absorbuje modré světlo (490 nm) a emituje žlutozelené (517 nm). K hodnocení testu se užívají fluorescenční mikroskopy se zdrojem UV záření a excitačními filtry. Imunofluorescence se používá ke studiu buněčných antigenů. V přímé metodě je je fluorochromem značena Ab proti sledovanému Ag, v nepřímé se k vizualizaci této Ab používá značené antiizotypové protilátky nebo značeného proteinu A, nebo je jedna z protilátek konjugována s biotinem a k jejímu průkazu se užije streptavidin konjugovaný s fluorochromem. Nepřímá metoda je citlivější než přímá.
Subpopulace lymfocytů označené protilátkami konjugovanými s fluorochromy mohou být analyzovány a děleny na základě intenzity fluorescence. K separaci buněk se používá přístroj fluorescence-activated cell sorter (FACS), který vychyluje buňky s laserem excitovaným fluorochromem v elektrickém poli (obr. 10).
Imunoelektronová mikroskopie:
Protilátky k buněčným komponentám jsou vizualizovány elektron-densními značkami - feritinem nebo koloidním zlatem. Protože tyto značky absorbují elektrony jeví se jako malé černé tečky. Při značení koloidním zlatem mohou být různé Ab značeny zlatými partikulemi různé velikosti, což umožňuje jejich odlišení na snímku.
Hybridomy a monoklonální protilátky
Kohler a Milstein (1975) - fúzovali normální plasmatické buňky s myelomovými buňkami a získali hybridní buňky (hybridomy), které získaly nesmrtelnost od myelomových buněk a schopnost produkovat Ab od plasmatických buněk.
Fúze dvou buněk lze dosáhnout působením viru Sendai nebo častěji polyetylénglykolu, agens, která podporují fúzi buněčných membrán (obr. 11). Vznikne mnohojaderný heterokaryon, jehož jaderné membrány postupně splynou a jedno velké jádro obsahuje chromozomy obou rodičů. Běhen dělení této hybridní buňky dochází k náhodným ztrátám chromozomů, dokud se buňka nestabilizuje. Pokud dojde ke ztrátě chromozomu potřebného pro přežití, buňka hyne. Hybridomy z myších a lidských buněk postupně ztratí všechny lidské chromozomy. K selekci hybridomových buněk na úkor rodičovských se používá selektivní medium obsahující hypoxantin, aminopterin a thymidin (HAT). Savčí buňky mají dvě dráhy pro syntézu nukleotidů - hlavní a náhradní. Když je hlavní dráha blokována aminopterinem, analogem kyseliny listové, buňky využívají náhradní dráhu katalyzovanou enzymy hypoxantin-guanin fosforibozyl transferázou (HGPRT) a thymidin kinázou. Mutace v kterémkoli z těchto enzymů blokuje tuto náhradní dráhu. HAT medium obsahuje aminopterin k zablokování hlavní dráhy a hypoxantin a thymidin pro náhradní dráhu. Pokud jsou k fúzi použity myelomové buňky s mutací v HGPRT, v HAT mediu rostou pouze hybridomové buňky, protože využívají náhradní dráhu získanou od B lymfocytů. Samotné lymfocyty pouze přežívají nekolik dnů, in vitro se nedělí.
Produkce monoklonálních protilátek:
Skládá se ze tří základních kroků: (1) konstrukce B hybridomů, (2) testování získaných klonů na produkci protilátky požadované specifity a (3) pomnožení vybraných hybridomů.
Zfúzované buňky se nasazují do jamek mikrotitračních panelů s tzv. feeder buňkami, což jsou nejčastěji peritoneální makrofágy nebo thymocyty. Po 5-10 dnech růstu v HAT mediu jsou viditelné kolonie hybridomových buněk, každá představuje klonální expanzi jedné hybridomové buňky.
K testování hybridomů na produkci požadovaných Ab se nejčastěji užívá technik jako je ELISA (obr. 12) a RIA, které umožňují současné vyšetření velkého počtu vzorků. Úspěšně bývá využita i imunofluorescence.
Pozitivní hybridomy se dále klonují metodou limitního ředění, kdy se buňky naředí tak, aby na jednu jamku mikropanelu připadla asi jedna buňka. Získají se tak klony buněk představující potomstvo jedné buňky a produkující monoklonální protilátky.
Monoklonální protilátky (MAbs) mohou být pak produkovány in vitro kultivací hybridomových buněk v mediu (výtěžek MAbs 10-100 mg/ml), nebo v peritoneu syngenních myší jako ascitické tekutiny (výtěžek MAbs 1-25 mg/ml). MAbs se z ascitickí tekutiny purifikují chromatografií.
Produkce lidských monoklonálních protilátek:
Problémem užití myších MAbs u lidí je antiizotypová reakce, která může vést až k alergickým komplikacím. Problémy se získáním lidských MAbs spočívají v imunizaci (pouze in vitro) a absenci vhodných myelomových buněk.
Alternativní cesta je přes infekci B buněk virem Epsteina a Barrové, čímž tyto buňky získají vlastnosti nádorových buněk a přitom sekretují požadovanou protilátku. Klonováním těchto transformovaných buněk je možno získat lidské MAbs.
Použití monoklonálních protilátek:
Purifikace proteinů:
Místo opakovaných chromatografií s nízkým výtěžkem je možno využít imunosorbentů, kde je MAb navázána na nějaký nosič (sefarózové kuličky) a specificky vychytává antigen ze směsi. Použití takové imunosorbentní kolony k vyčištění hrubého preparátu interferonu vedlo k 5000násobnému zvýšení čistoty.
Identifikace a izolace lymfocytárních subpopulací a klonů:
Protože subpopulace lymfocytů nebo jejich různá diferenciační stadia nesou na povrchu charakteristické antigeny, mohou být MAbs využity k jejich rozlišení (např. separace CD4+ a CD8+ buněk pomocí FACS). Určitá subpopulace může být ze směsi odstraněna působením MAb a komplementu. Klonotypické MAbs rozpoznávají membránové proteiny jedinečné pro určitý lymfocytární klon.
Identifikace nádorových buněk:
Nádorové buňky nesou specifické antigeny, které je odlišují od netransformovaných buněk. MAbs proti těmto antigenům umožňují detekci tumorů, např. metastáz ve velmi časném stadiu. Problémem je však to, že řada tumorů nenese společný specifický antigen.
Likvidace nádorových buněk:
MAbs společně s komplementem mohou zabíjet nádorové buňky. Pomocí velkých dávek specifických MAbs se podařilo vyléčit pacienta s metastázovaným B lymfomem. V případě, že jsou nádorové buňky rezistentní k lýze zprostředkované komplementem, nádorově specifická MAb se konjuguje s radioizotopem nebo toxinem a vzniklý imunotoxin je může rozpoznat a zabít (obr. 13). Užívají se ricin, Shigella toxin a difterický toxin. Každý z těchto toxinů sestává ze dvou nebo více polypeptidových komponent - ze samotného toxinu a ligandy, která se váže na buněčný receptor. Tento vazebný polypeptid je u imunotoxinu zaměněn za protilátkovou molekulu specificky rozpoznávající nádorovou buňku.
Diagnostické reagencie:
Existují stovky MAbs usnadňujících diagnostiku infekčních chorob, monitorování terapeutických léků, detekci diabetu, tumorových buněk, průkaz těhotenství, mapování HLA antigenů atd.
Modifikace monoklonálních protilátek užitím technologie rekombinantní DNA:
Chimerické monoklonální protilátky:
Připraví se rekombinantní DNA obsahující promotor a sekvence pro variabilní oblast protilátky z myšího protilátkového genu a exony kódující konstantní oblast z genu pro lidskou protilátku. Antigenní specifita odpovídá myší protilátce, izotyp je lidský. Tyto chimerické protilátky jsou méně imunogenní, pokud jsou injikovány lidem. Byly připraveny i chimerické MAbs obsahující pouze myší CDR, v lidské protilátkové molekule.
Lze také připravit heterokonjugáty jako hybridy dvou odlišných protilátkových molekul. Polovina protilátkové molekuly má specifitu pro nádorovou buňku, druhá polovina pro povrchovou molekulu na imunní efektorové buňce (NK buňka, aktivovaný makrofág, Tc lymfocyt). Tyto heterokonjugáty slouží k přemostění efektorových a tumorových buněk.
Příprava monoklonálních protilátek z imunoglobulinových genových knihoven:
Nová technologie přípravy MAbs bez hybridomů a dokonce bez imunizace. K amplifikaci DNA kódující lehké a těžké řetězce Fab fragmentů z hybridomových nebo plazmatických buněk se použije PCR. Knihovny lehkých a těžkých řetězců jsou konstruovány v bakteriofágu lambda. Pomocí restrikčního enzymu EcoRI jsou připraveny náhodné kombinace lehkých a těžkých řetězců. Tento postup vede ke vzniku obrovské diverzity protilátkových kombinací. Klony obsahující tyto náhodné kombinace se pak testují na specifitu pro vybraný antigen.
Katalytické monoklonální protilátky (abzymy):
Vazba protilátky na antigen je v mnoha směrech podobná jako vazba enzymu na substrát. Enzym využívá své vazebné energie ke stabilizaci tranzičního stavu substrátu a tak snižuje aktivační energii potřebnou pro chemickou modifikaci substrátu. Proto byl připraven komplex hapten-nosič, ve kterém hapten strukturálně napodoboval tranziční stav esteru, podléhajícího hydrolýze. Když byly anti-haptenové MAbs inkubovány s esterem, některé urychlovaly hydrolýzu až 1000x. Katalytická aktivita těchto protilátek byla vysoce specifická. Tyto protilátky byly nazvány abzymy. Produkce velkého množství monoklonálních protilátek pomocí imunoglobulinových genových knihoven umožnila získání řady MAbs s katalytickou aktivitou. Předpokládá se, že tímto způsobem se může podařit připravit baterie abzymů, které budou štípat peptidové řetězce ve specifických místech podobně jako restrikční enzymy.
T hybridomy:
Jsou připravovány fúzí stimulovaných T buněk s nádorovými T buňkami (thymomové buňky) podobně jako B hybridomy. T hybridomy sekretují interleukíny nebo mají cytotoxickou aktivitu. Konstrukce T hybridomů přispěla k poznání struktury a funkce interleukinů, T receptorů a dalších T-specifických molekul.
| 