| Precipitační reakce (obr. 4):
Interakce mezi Ab a rozpustným Ag vytváří síť, která je stabilizována hydrofobními silami, což činí Ab-Ag komplex nerozpustným. Protilátka musí být bivalentní, Ag musí nést dvě nebo více kopií téhož epitopu. Např myoglobin je dobře precipitován polyklonálními séry ale ne monoklonální protilátkou protože obsahuje mnoho odlišných Ag determinant pouze s jednou kopií každé determinanty.
Precipitace v roztoku:
Kvantitativní precipitační reakce se provádí ve zkumavkách do kterých se přidá konstantní množství Ab a vzrůstající množství Ag. Precipitát se odcentrifuguje a jeho množství se změří. Vynesením množství precipitátu proti zvyšující se koncentraci Ag se získá precipitační křivka, která má vzestupnou část, sestupnou část a zónu ekvivalence, kdy je optimální poměr Ab:Ag. V zóně nadbytku Ab se tvoří malé rozpustné komplexy tvořené několika molekulami Ab vázajícími jednu molekulu Ag. V oblasti nadbytku Ag se váže jedna nebo dvě molekuly Ag k jedné molekule Ab a síť se netvoří. Tato metoda se někdy používá ve formě prstencového testu, kde se antisérum v malé zkumavce převrství antigenem. Ag i Ab difundují proti sobě a v zóně ekvivalence se vytvoří prstencový precipitát.
Precipitační reakce v gelech:
Ag a Ab difundují proti sobě v agaru a v zóně ekvivalence se vytvoří viditelný precipitát. Imunodifuzní technikou, kdy Ag difunduje z jamky do agaru obsahujícím protilátku, je možno určit neznámou koncentraci antigenu ze standardní křivky získané vynesením průměrů precipitačních kroužků proti log příslušných koncentrací antigenu. Metoda se nazývá Manciniho jednoduchá radiální imunodifuse a rutinně se používá ke kvantifikaci jednotlivých tříd sérových imunoglobulinů, nebo složek komplementu. Citlivost metody je 5-10 mg/ml.
V Ouchterlonyho metodě dvojité imunodifuse (obr. 5) Ag i Ab difundují proti sobě z jamek vyříznutých v agaru a vytvářejí koncentrační gradient. Tato jednoduchá technika umožňuje zjistit vztah mezi antigeny i to, kolik Ab-Ag systémů je přítomno. Pokud se dva Ag umístí do sousedních jamek a jsou testovány proti jednomu séru, získané precipitační linie umožní zjistit, zda tyto Ag sdílejí společný epitop (linie částečné identity), jsou identické (linie identity) nebo zcela odlišné (linie nonidentity).
Imunoelektroforéza (imunoelfo obr. 6) kombinuje elektroforetickou separaci s dvojitou imunodifuzí. Směs antigenů je rozdělena elektroforézou v agaru, pak jsou v agaru ve směru elektrického pole vyříznuty žlábky, které jsou naplněny antisérem. Antigeny a protilátky difundují proti sobě a vytvářejí precipitační linie. Imunoelfo je užívána v laboratořích k detekci přítomnosti jednotlivých proteinů v séru (imunodeficience). Je to pouze kvalitativní technika.
Raketová elektroforéza (obr. 7) umožňuje i kvantifikaci antigenu až do koncentrace 20 ug/ml. Negativně nabitý Ag elektroforeticky migruje v gelu obsahujícím Ab. Precipitát má tvar rakety, jejíž výška odpovídá koncentraci Ag. Modifikace raketové elfo nazvaná dvousměrná imunoelektroforéza, umožňuje kvantifikovat několik antigenů ve směsi.
Aglutinační reakce:
Interakce mezi protilátkou a partikulárním antigenem vede ke vzniku viditelných shluků - k aglutinaci. Nadbytek Ab inhibuje aglutinační reakci (efekt prozóny).
Hemaglutinační reakce je rutinně prováděna při stanovení krevních skupin. Při neutrálním pH jsou erytrocyty obklopeny negativním iontovým mrakem, takže se navzájem odpuzují (odpudivé síly se nazývají zeta potenciál). IgM může překonat zeta potenciál a vyvolat hemaglutinaci. IgG je mnohem méně efektivní. Hemaglutinace se používá i při stanovení Rh fenotypu.
Produkce sérových Ab při bakteriální infekci se využívá při bakteriální aglutinaci. Aglutinační titr je definován jako recipoká hodnota nejvyššího ředění séra, které ještě vyvolá aglutinaci. Aglutinační rekce slouží nejen při diagnostice bakteriálních infekcí, ale i k serotypizaci bakterií.
Pasivní hemaglutinace je založena na navázání antigenů na červené krvinky a jejich aglutinaci antisérem proti tomuto Ag. K navazování Ag se užívá taninová kyselina nebo chlorid chromitý. Pasivní hemaglutinace je daleko citlivější než precipitační reakce a může detegovat Ab ještě v koncentraci 0,001 mg/ml.
Inhibice aglutinace je velmi citlivá metoda, umožňující detekci malých množství antigenu. Ag je navázán např. na latexové partikule a v testu je přítomná protilátka proti tomuto Ag, která aglutinuje. Přítomnost totožného Ag ve zkoumaném vzorku inhibuje aglutinaci, protože tento Ag obsadí vazebná místa Ab. Tento test se používá i k průkazu užívání drog (kokain, heroin). Některé viry spontánně hemaglutinují a proto inhibice hemaglutinace sérovými protilátkami může být využita k diagnostice (zarděnky, chřipka).
Radioimunoassay (RIA obr. 8):
RIA je vysoce citlivá technika schopná prokázat pikogramy (10-12g) antigenu nebo protilátky. Rosalyn Yalow dostala za vývoj této techniky v roce 1977 Nobelovu cenu. Principem je soutěžení mezi radioaktivně značeným Ag a neznačenýn Ag o vazbu s vysoce afinní Ab. Značí se obvykle 125I (gama zářič) a značený Ag je smíchán s Ab v takové koncentraci, že právě saturuje vazebná místa na Ab molekule. Přidání neznačeného Ag vede k vytěsnění značeného Ag z vazby na Ab, které je úměrné koncentraci neznačeného Ag. Měření uvolněného značeného Ag umožňuje určit koncentraci neznačeného Ag. Protilátka s navázaným Ag je vyprecipitována z roztoku anti-izotypovým sérem nebo proteinem A ze Staphylococcus aureus. Některé metody využívají navázání Ab na pevnou fázi, což mohou být sefarózové kuličky nebo mikrotitrační destička. Tato metoda byla použita např. k detekci viru sérové hepatitidy B, což mělo velký význam pro vyřazení infikovaných dárců krve.
Imunoenzymatická metoda:
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) je založena na podobném principu jako RIA a má srovnatelnou citlivost. Místo značení radioizotopem se užívá navázání enzymu na protilátku. Reakce enzymu s bezbarvým substrátem vede k barevnému produktu, jehož množství lze spektrofotometricky měřit. Používají se enzymy peroxidáza, alkalická fosfatáza a další. Existují různé typy ELISA testů, kdy je na destičku navázán Ag nebo Ab a které se liší počtem dalších vrstev. Nepřímá ELISA s vrstvami Ag, sérová Ab, antiizotypová Ab značená peroxidázou se užívá k průkazu sérových protilátek proti HIV.
Western blotting (obr. 9):
Slouží k identifikaci specifického proteinu ve směsi proteinů, nebo protilátky k danému proteinu. V této metodě jsou proteiny elektroforeticky separovány v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsulfátu sodného. Proteinové proužky jsou elektroforeticky přeneseny na nitrocelulózovou membránu a jednotlivé proteiny jsou identifikovány protilátkou značenou izotopem nebo enzymem.
Imunofluorescence:
Vazba Ab na Ag je vizualizavána označením protilátky fluorochromem. Nejčastěji užívanými fluorochromy jsou fluorescein a rhodamin. Oba mohou být konjugovány s Fc oblastí protilátkové molekuly aniž dojde k poškození antigen-vazebné kapacity. Tyto fluorochromy absorbují světlo určité vlnové délky a emitují světlo o vyšší vlnové délce. Např fluorescein absorbuje modré světlo (490 nm) a emituje žlutozelené (517 nm). K hodnocení testu se užívají fluorescenční mikroskopy se zdrojem UV záření a excitačními filtry. Imunofluorescence se používá ke studiu buněčných antigenů. V přímé metodě je je fluorochromem značena Ab proti sledovanému Ag, v nepřímé se k vizualizaci této Ab používá značené antiizotypové protilátky nebo značeného proteinu A, nebo je jedna z protilátek konjugována s biotinem a k jejímu průkazu se užije streptavidin konjugovaný s fluorochromem. Nepřímá metoda je citlivější než přímá.
Subpopulace lymfocytů označené protilátkami konjugovanými s fluorochromy mohou být analyzovány a děleny na základě intenzity fluorescence. K separaci buněk se používá přístroj fluorescence-activated cell sorter (FACS), který vychyluje buňky s laserem excitovaným fluorochromem v elektrickém poli (obr. 10).
Imunoelektronová mikroskopie:
Protilátky k buněčným komponentám jsou vizualizovány elektron-densními značkami - feritinem nebo koloidním zlatem. Protože tyto značky absorbují elektrony jeví se jako malé černé tečky. Při značení koloidním zlatem mohou být různé Ab značeny zlatými partikulemi různé velikosti, což umožňuje jejich odlišení na snímku.
| 