Įvadas
Šiuo metu apie fermentus, kaip apie biokatalizatorius, galima pasakyti gana nemažai. Susipažinta su šių baltyminės kilmės medžiagų struktūrinėmis ypatybėmis (Kadziauskas. 2008), sąveikos su substratais pobūdžiu, bendrais katalizės mechanizmo, inhibicijos principais (Cox et al. 2008; Belitz et al. 2009) ir kt. Nustatyta, kad fermentų pagalba foninis reakcijos greitis gali būti padidintas 1010, 1012 ar net 1016 kartų (Kadziauskas. 2008). Būtent todėl šios biomolekulės yra tokios patrauklios inžinieriams. Svarbu žinoti fermentų įtaką vykstantiems (bio)cheminiams procesams, bet dar svarbiau — nusakyti tai kiekybiškai.
Fermentas apibūdinamas tokiomis charakteristikomis kaip katalitine konstanta, apibrėžiančia jo efektyvumą (apsukas), ir fermento-substrato komplekso disociacijos konstanta, vadinama Michaelio konstanta, kuri nusako fermento specifiškumą (giminingumą) substratui. Šių parametrų nustatymui kuriami matematiniai modeliai. Savo ruožtu, gautus parametrus įsistačius į matematinius modelius galima numatyti, kaip reakcija vyks laiko atžvilgiu, t.y. kokie komponentų kiekiai bus sistemoje konkrečiu laiko momentu. Vadinasi galima teigti, kad inžineriniu požiūriu katalitinė ir Michaelio konstantos visiškai apibūdina fermento veikimą.
Taigi, iš eksperimentinių duomenų nustatomas produkto kaupimosi greitis, kuris reikalingas fermento efektyvumui ir specifiškumui įvertinti. Biochemijos laboratorijose iki šiol reakcijos greičio nustatymui naudojami metodai, apimantys tik mažą dalį pradinių rezultatų (Cornish-Bowden et al. 1975). Išties fermentinės reakcijos greitis priklauso nuo daugelio aplinkybių ir gali kisti proceso eigoje, tad gali ir skirtis nuo pradinio reakcijos greičio. Kuo didesnis laiko intervalas nagrinėjamas, tuo pastebimas didesnis greičio pokytis, lyginant su pradiniu reakcijos greičiu. Taip pat šis intervalas negali būti pasirenkamas per trumpas, mat produkto kiekis turi būti pakankamas, kad būtų įmanoma jį tiksliai fiksuoti, kas paprastai esant nedideliems medžiagos kiekiams sudėtinga dėl prietaisų jautrumo triukšmams ir kintančioms sąlygoms. Kitaip tariant, būtina analizei apjungti pakankamą kiekį eksperimentinių duomenų. Tuo tarpu kompiuterių teikiama galimybe į greičio skaičiavimą įtraukti daugiau duomenų ir gauti reiškmes, tiksliau atspindinčias viso proceso vyksmą, naudojamasi rečiau. Be to, tolimesnei analizei paprastai pasitelkiami metodai, kurie jau pasenę. Jie susiję su grafikų koordinačių transformacijomis, pavyzdžiui, Lineweaver–Burk koordinačių atveju. Šie metodai, kadaise gan patogūs taikyti modelius prie duomenų rankiniu būdu, dabar, atsiradus naujoms skaičiavimo technikos galimybėms, yra nebetinkami dėl rezultatų interpretavimo sunkumų.
Šiuo darbu parodyta, kad tikslingiau yra taikyti statistinius duomenų analizės metodus. Matematiniu modeliavimu, panaudojant visus gautus eksperimentinius duomenis, produkto kaupimosi greitis gali būti nustatytas daug tiksliau, taip pat šiuo metodu galima daug paprasčiau nustatyti tokius parametrus kaip fermento
efektyvumas ir specifiškumas.
Turint omenyje, kad inžineriniu požiūriu svarbiausios būtent skaitinės fermentą apibūdinančios charakteristikos, darbe dėmesys skiriamas tiksliam parametrų nustatymui, per daug nesigilinant į molekulinius fermentinių procesų pagrindus.
Buvo tiriami grįžtamos ir negrįžtamos katalizės atvejai. Tam tikslui pasirinkti fermentai šarminė fosfatazė (ALP) ir alkoholdehidrogenazė (ADH).
Duomenų registravimo metodai
Negrįžtama katalizė. Negrįžtamai katalizei tirti pasirinkta šarminė fosfatazė (EC 3.1.3.1). Fermentas defosforilina fosfato grupę turinčius junginius (baltymus, polinukleotidines sekas, alkaloidus) ir yra plačiai naudojamas genų inžinerijos darbuose ar tiriant baltymų vaidmenį metabolizmo procesuose. Šiame darbe naudojama VIII-ojo tipo šarminė fosfatazė (140 kDa), išskirta iš triušio žarnyno. Tiriamas enzimas katalizuoja p-nitrofenolfosfato (p-NPP) defosforilinimą, susidarant p-nitrofenolio (p-NP) produktui. Vykstanti reakcija aprašoma taip (Bagdonienė
et al. 2006):
Fermentinė reakcija atliekama kiuvetėje (l = 1 cm). Bendrasis reakcijos mišinio tūris yra 3 mL. Kontrolinės kiuvetės turinys susideda iš 0,1 mL p-NPP tam tikros koncentracijos tirpalo ir 2,9 mL 1,5 M TRIS-HCl buferio (pH = 8, 22°C). Reakcija stebima į kiuvetę dedant 0,1 mL tam tikros koncentracijos substrato tirpalo, 2,8 mL 1,5 M TRIS-HCl buferio ir 0,1 M 0,85 μM šarminės fosfatazės tirpalo. Pirmąsias keturias reakcijos minutes spektrofotometru prie 410 nm ilgio bangos registruojamas p-NP optinis tankis. Atliekama eilė bandymų esant tokioms substrato koncentracijoms (mM): 0,111, 0,222, 0,444, 0,666, 0,888, 1,111, 2,222, 4,444, 6,666, 8,888, 11,11, 22,22, 33,33, 44,44. Ta pati bandymų seka atliekama dar kartą, kad būtų gaunami du duomenų rinkiniai.
Grįžtama katalizė. Grįžtamos katalizės tyrimams pasirinkta alkoholdehidrogenazė (EC 1.1.1.1). Ji spartina žemesniųjų alkoholių (metanolio, etanolio, propanolio) oksidaciją iki aldehidų. Fermentas yra atsakingas už pradinį alkoholio detoksikacijos procesą žinduolių organizmuose. Šiuo atveju tiriama ADH (149,5kDa), katalizuojanti etanolio oksidaciją iki acetaldehido (etanalio). Skirtingai nei šarminės fosfatazės atveju, fermentas yra priklausomas nuo nikotinamidadenindinuk-leotido (NAD
+), kuris yra dehidrogenazės kofaktorius. Vyksta tokia reakcija (Lazdauskaitė
et al. 2004):
Ši reakcija taip pat atliekama kiuvetėje. Bendrasis reakcijos mišinio tūris lygus 3 mL (Bumelienė
et al. 2005). Kontrolinis tirpalas sudarytas iš 0,1 mL 0,015 M NAD
+ tirpalo, 0,1 mL tam tikros koncentracijos etanolio tirpalo, 0,5 mL 0,06 M natrio pirofosfatinio buferio (pH = 8,5) ir 2,3 mL vandens. Tuo tarpu cheminės reakcijos mišinys turi tuos pačius komponentus, tik čia imama ne 2,3, o 2,2 mL vandens ir į visą mišinį pridedama 0,1 mL 0,067 μM ADH tirpalo. Sistema yra termostatuojama 30° temperatūroje. NADH optinis tankis registruojamas prie 340 nm ilgio bangos pirmąsias tris minutes. Atliekamos reakcijos su tokiomis etanolio koncentracijomis (mM): 2, 6, 10, 15, 20, 60, 100, 150, 200, 250, 300, 400. Bandymų seka atliekama dar kartą.
Matematinio modeliavimo metodai ir rezultatai
Šarminė fosfatazė. Fermento katalizuojamo proceso lygtį galima išreikšti tokia schema:
