Toshkent farmatsevtika instituti

III.NAZARIY MATERIALLAR

Mavzu-1: Immun sistema va uning faoliyati

1.Immun sistema haqida tushuncha

2. Timusni tuzilishi

3. Fabrsius jaltachasi tuzilishi funksiyalari

5.S uyak ko‘migining tuzilishi

Suyak kumigi. Sut emizuvchilar organizmida suyak kumigi V — kujayralarning etiladigan manbai xi-soblanadi. Bunda V — kujayralar uzak kujayralari-dan kosil bulib, tashki kavatida immunoglobulin mo-lekulalarini tashuvchi kichik limfotsitlarga aylanadi. Suyak kumigi uzida limfoid bulmagan va uta geterogen (turli-tuman) xujayralar populyasiyasini saklaydi. Suyak kumigini limfoid a’zo bulishiga karamasdan, immunologii a’zo deb x;am karash mumkin, chunki u postnatal rivojlanish davrida turli limfotsit va va makrofag populyasiyalarini kosil kiluvchi utmish-dosh kujayralarni uzi bilan ergashtirib keladi. Ma’-lumki, ikoh kujayralarining xosil bulish jarayoni gematopozz deb ataladi, ushbu kujayralarni kosil si-luvchi tupima esa gematopoetik tupima deb nomlangan.Gematopoetik tukimaning ikki turi mavjud. Ulardan biri, mieloid, ikkinchisi esa limfoid turlaridir.

1.Immun sistema haqida tushuncha bering

2. Timus qanday qismlardan tuzilgan?

3. Fabrsius jaltachasi tuzilishi va funksiyalarini tushuntiring

5.S uyak ko‘migining tuzilishi haqida tushuncha bering

1.Limfoid tizim haqida tushuncha

2.Limfa tugunlari

3.Gumoral immunitet haqida tushuncha.

4.Xujayraviy immunitet vazifalari

5.Taloqning ikkilamchi limfoid organ sifatidagi vazifasi

Talokning ustki kkismi biriktiruvchi tukimadan tashkil topgan va kapsula bilan uralgan. Uning ichki kismini pulpa tashkil kiladi. Talok tarkibida pul­pa ikki xil buladi: biri ok pulpa bulsa, ikkinchi-si — kizildir. Ok pulpa talovda juda mayda, kat-tщ va kulrang kosila kabi, kizil pulpa orasida so-chilgan buladi. Limfatik follikullarni kamrab ol-gan kizil pulpa uz kataklarida kup mikdorda erit-rotsitlarni saklaydi. kozirgacha ok va kizil pulpa-lar orasidagi chegara ani!\langani yuk, lekin shu ikki pulpa orasida marginal mintaka mavjud. Xuddi shu marginal mintakada follikullar tarkibiga kiradi-gan kon tomirlari yotadi. Marginal mintakaga arte-riyalar sirkulyasiyasida bulgan limfotsitlar kelib tu-shadi.Kkon tarkibidagi antigen xam, shu mintakaga kelib tushishi va u erda kozir bulgan makrofaglar yordamida fagotsitozga uchrashi mumkin. Buning natijasida V — limfotsitlar faollashsa, ular avvaliga bulina bosh-laydi, keyin esa antitana kosil kiluvchi kujayralar darajasiga kutariladi.²¹

1.Limfoid tizim haqida tushuncha bering

2.Limfa tugunlari qanday vazifani bajaradi?

3.Gumoral immunitet haqida tushuncha bering

4.Xujayraviy immunitet vazifalari nimalardan iborat?

5.Taloqning nima uchun ikkilamchi limfoid organ hisoblanadi?

5. 
   Antitelalar faol markazi va uning roli.
   
6. 
   Immunoglobulinlarga proteolitik fermentlar ta’siri
   
7. 
   Immunoglobulinlar sintezida makrofaglarni ahamiyati
   
8. 
   Komplement sistema va uning faollashuvi
   

Antigen – bu yot modda bo‘lib, u organizmga kirishi bilanoq o‘ziga qarshi va spetsefik bo‘lgan, o‘z navbatida antigen bilan o‘zaro ta’sirlashadigan yangi oqsillarni vujudga keltiruvchi immunogen faol modda hisoblanadi. Antigen sifatida turli moddalapr jumladan, mikroorganizmlar, viruslar, polisaxaridlar, turli oqsil moddalar, hujayra, hottoki to‘qimalar ham rol o‘ynashi mumkin. Umuman olganda antigen deb shunday moddani aytish mumkinki, ya’ni organizm uchun yot bo‘lgan modda organizmda unga qarshi bo‘lgan yangi oqsil moddani – glikoprteidlar sinfiga kiruvchi immunoglobulinlarni sintezlanishiga olib keshishi kerak. Bordiyu yot modda organizmga kirsa, antitelolar hosil bo‘lmasa, bunday moddalar serologik jihatdan faol modda hisoblanmaydi. Biologik faol moddaga nisbatan antitelalar hosil qilish kerak bo‘lsa, avvvalo ana shu moddaning titri, ya’ni serologik jihatdan faollligi aniqlanadi. So‘ngra immunologik jihatdan stimullovchi moddalar bilan (adyuvand Freyd moddasi yoki boshqa stimulyatorlar) xayvon organizmiga yuboriladi va shundan so‘ng organizmda antitelalar hosil bo‘lish jarayoni kuchayadi. Organizmda sintezlangan antitelolarda faol markazlari mavjud bo‘lib, V- variabel qismi deb yuritiladi. Antitelalar ana shu variabel qismi bilan antigen bilan o‘zaro ta’sirlashib bog‘langanda, ulardagi faol markazlar muhim rol o‘ynaydi. Antigenda mavjud bo‘lgan faol markaz, ya’ni antitelo bilan bog‘lanadigan qismi - antigen determinanti deb ataladi.

Immun sistemani faoliyatini kuchaytiruvchi va vujudga keltiruvchi antigen, yuqorida qayd etganimizdek, immunogenlik xususiyati kuchli modda hisoblanadi. Ko‘pincha antigenlar oqsil tabiatiga ega moddalar bo‘lib, organizmda albatta ma’lum bir immunologik reaksiya turini amalga oshiradi. Axmmo antigenlik xossalari past bo‘lgan, ba’zi boshqa turdagi moddalar ham mavjuddir. Masalan, nuklein kislotalar, antibiotiklar, garmonlar, yog‘lar, gaptenlar shular jumlasidandir.

Antigenlik yoki immunogenlik xususiyati past bo‘lgan moddalar asosan kichik molekulali moddalar hisoblanib, ular gaptenlar deb yuritiladi. Kichik molekulali birikmalarni o‘zaro yoki boshqa makromolekulalar bilan birlashtirib /assotsiatlarni, ya’ni immunogenlik xususiyatini hosil qiluvchi moddalar/ gibrid, molekulyar massasi katta bo‘lgan moddalarni sintezlash mumkin. Bundan tashqari antigenlarni sun’iy ravishda olish mumkin. Hozirga kunda sun’iy sintezlangan makromolekulalar hosil qilish bilan immunoximiya yo‘nalishida faoliyat ko‘rsatayoigan bir guruh olimlar shug‘ullanishmoqda.

Antigen haqida so‘z borganda shuni aytib o‘tish lozimki, antigenlar faqat tashqi muhitdan kiradigan moddalar hisoblanmay, balki organizmda fiziologik o‘zgarishlar natijasida hosil bo‘lgan, organizmning shaxsiy o‘ziga xos molekulalari ham antigen hisoblanadi. Ular ham spitsefik oqsillar-antitelolar hosil bo‘lishiga ko‘maklashadigan, genetik jihatdan muhim ahamiyatga ega bo‘lgan oqsil tabiatli moddalar guruhi hisoblanadi.

Immunoglobulinlar gruppasiga kiruvchi barcha murakkab oqsillar plazma oqsillaridir. Antitelolarni ya’ni immunoglobulinlarni kimyoviy tuzilishi, funksiyalari juda mukammal o‘rganilgan. Ularda ikki turdagi zanjir mavjud bo‘lib, ularning og‘ir zpnjirlari N-zanjir va engil zanjirlari esa L- zanjir deb yuritiladi. Ushbu zanjirlar turli og‘irlikka ega bo‘lib, 4 ta polipeptid zanjirdan ya’ni 2ta og‘ir va 2ta engil zanjirdan tuzilgan. Quyida ko‘rsatilgan rasmda antitelani tuzilishi va uning qanday qismlardan tashkil topganligi sxematik ravishda tasvirlangan. Og‘ir va engil zanjirlar bir-bilan sulfid ko‘priklari orqali bog‘langan / -N/ bog‘lar. Xuddi shunday bog‘lar ikkala og‘ir zanjirlar orasida ham bor. Har bir engil va har bir og‘ir zanjirlarda ichki bog‘lar mavjud bo‘lib, ular ikki tipdagi uchastkalarga ajraladi: doimiy uchastkaga- ya’ni har xil immunoglobulinlarda turlicha bo‘ladigan aminokislotalar ketma-ketligidan iborat qismga, /S va SN uchastkalar/ va doimiy bo‘lmagan qismga, ya’ni variabel uchastka, ularda aminokislotalar ketma-ketligi o‘zgaradi. Immunoglobulinlarning giper-variabel qismi antitelaning faol markazi hisoblanib, ushbu qism segmetlari to‘g‘ridan to‘g‘ri u yoki bu antigen bilan o‘zaro ta’sirlashib bog‘lanish uchun javobgardir. Har qaysi uchastka 60-70tagacha aminokislota qoldig‘idan tashkil topgan, xalqa shakliga ega bo‘lib, fazoviy ko‘rinishda tahlangan tuzilishga ega bo‘lib ko‘rinadi.

Ikkita og‘ir zanjirning S-oxirgi bo‘laklari immunoglobulin molekulasida effektor qismi hisoblanib, ba’zi fiziologik faol moddalarni, masalan komplementni bog‘lash vazifasini bajaradi. Antitela bilan ta’sirlashgan antigen antitelani boqlovchi uchastkani hosil qiladi. Variabel va konstant uchastkalar funsional uchastkalar bo‘lib, antigenni tanishga javobgardir. Immunoglobulinlarda N-bog‘larni turiga qarab, ularni 5ta sinfga ajratish mumkin. Masalan IgA, IgM, IgD va IgG, IgE ga ajratiladi. Ularni tuzilishi ikiinchi rasmda ko‘rsatilgan. Immunoglobulinlarni og‘ir zanjirlari, H zanjirdagi – bog‘lari jiddiy farqlanadi. Engil va og‘ir zanjirlarni bir-biriga solishtirish ular strukturasida o‘xshash aminokislotalar ketma-ketligi mavjudligini ko‘rish mumkin. Immunoglobulinlarning zanjirlarini sshngi uchastkasi S – uchastka deb belgilanadi va antitelaning konstant qismi hisoblanadi. Ohir zanjirdagi konstant qism- Sn uchastka leb yuritiladi. Bundan tashqari og‘ir va engil zanjirlarda domenlar mavjud bo‘lib, ular immunoglobulin harakatini ta’minlaydi. Og‘ir zanjirda 3ta, engil zanjirda esa 1tadan domen mavjuddir. Og‘ir zanjirdagi domenlar varmabel va konstant domenlarga bo‘linadi. Sn1 og‘ir zanjirning birinchi konstant domenini bildiradi..

Immunoglobulinlar o‘zlariga xos bo‘lgan, alohida genlarda sintezlanadiler. DNK strukturasida immunoglobulinlarni doimiy va variabel uchastkalar hakida ma’lumot yozilgan gen uchastkalari bo‘ladi. Ushbu gen uchastkalari bir necha tur antitelar hosil kilishga javobgar hisoblanadi. Hujayra darajasida immunoglobulinlarni hosil bo‘lishi uch turdagi xujayralarni kelishilgan ishtirokida kechadi, ya’ni T - limfotsitlar V - limfotsitlar va makrofaglar. Makrofaglar komplement sistemasi uchun retseptorlarga ega hujayra hisoblanadi. Organizmga tushgan antigen spetsifik kompleks ko‘rinishida T xujayraga va makrofagga yoki faqat makrofagga bog‘lanadi. Makrofag antigenni antitelolar sintezini stimullaydigon immunogenga aylantiradi. Makrofagni antigen bilan bog‘lanishi V-limfotsitlarni ko‘payishiga ham sabab bo‘ladi. V- limfotsitlar antitelalarni sintezini boshlash uchun, plazmatik xujayralarga aylanadi va o‘ziga xos antitelalarni sintezlay boshlaydi.

Antitelalar faol markazi va uning roli. Antitelalar molekulalari orasidagi ingichka bo‘shlik antigen bog‘lovchi maydonni hosil qiladi. Faol markazda gipervariabel’ yuqori darajada o‘zgaruvchanlikka ega uchastka sigmentlari joylashgan bo‘ladi. Aminokislota ketma-ketligi bilan farqlanadigan antigen bog‘lovchi uchastka antigen determinantini komplementar o‘zaro ta’sirini ham ta’minlaydi. Bu o‘rinda shuni aytib o‘tish lozimki, bitta politseptid zanjiridan hosil bo‘ladigon fermentlarning aktiv markazidan farqi o‘laroq, antitelalarda kombinatsion xilma- xillikni ta’minlaydigon ikkita zanjir ishtirok etadi. Buning natijasida ularda yangi xususiyatlar vujudga kelib, ular polispetsifik hisoblanadi, ya’ni birgina antitela molekulasi, bir kator antigenlar to‘plamiga komplementar bo‘lishi mumkin. Bunday holatda, antitela o‘xshash tuzilishga ega antigen determinantlari hamda umuman boshqa struktupara ega determinant bilan ham birikishi mumkin.²²

Nazorat savollari:

1.Antitelalar faol markazining tuzilishi

2.Immunoglobulinlarga proteolitik fermentlar qanday ta’sir ko‘rsatadi?

3.Immunoglobulinlar sintezida makrofaglarni roli nimada?

4.Komplement sistema haqida tushuncha bering

5. Komplement sistema va uning faollashuvi qanday amalga oshadi?

1.Immun javob hosil bulishi

2.Birlamchi immun javobni hosilbo‘lishi

3. Ikkilamchi immun javobni hosil bo‘lishi

senrifugulanadi. So‘ngra, xosil bo‘lgan cho‘kmani 1 ml fosfat buferida eritb, so‘ngra 18 soat davomida dializ qilinadi. Immunoglobulinlarning konsentratsiyasi spektorfotometrda 280nm aniqlanadi va formula yordamida xisoblanadi. ²³

1. Organizmda immun javob hosil bulishini tushuntiring

2.Birlamchi immun javobni hosil bo‘lishida qanday faktorlar muhim rol o‘ynaydi?

3. Ikkilamchi immun javobni hosil bo‘lishida qanday faktorlar muhim rol o‘ynaydi?

4. IgM va IgGlarning funksiyalari va xususiyatlari.

“SWOT-tahlil” metodi

6. 
   Immunologik reaksiya mohiyati.
   
7. 
   Imun kompleksning hosil bulishi
   
8. 
   Polivalent antigenlar
   
9. 
   Flyuretsent moddalar yordamida antitanani nishonlash
   
10. 
    Ferment yordamida antitanani nishonlash
    

Biroq cho‘kmaga tushgan kompleks har doim ham maksimal miqdorda bo‘lavermaydi, chunki pretsipitatsiya reaksiya borishi uchun antigen ko‘p miqdorda bo‘lishi kerak.

Serologik reaksiyalarni aniqlashda keng tarqalgan metodlardan biri agar gelining poralarida qo‘sh diffuziya metodi hisoblanadi. Antigen va antitelaning o‘zaro ta’sirida ularni uchrashish /qo‘shilishi/ joyida pretsipitatsiya chizigi hosil bo‘ladi. Bu reaksiya ikkala immun komponentning bir-biriga spetsifikligini bilish uchun juda muhimdir. Immun komponentlar spetsifikligini aniqlash usullaridan yana biri immunoelextroforez usuli hisoblanadi. Bunda bir yunalish buyicha antigenlarni, boshqa yunalish buyicha esa antitelalarni ajratish mumkin bqladi.

Immun komponentlarni aniqlashda ularning sezgirligini oshiruvchi usullar ham mavjud bo‘lib, ushbu usulga misol qilib, radioimmunologik metodni aytib shtish mumkin. Radioimmunologik usul o‘ta yukori sezgirlikka ega bo‘lib, bunda antigen va antitela radiaktiv izotop bilan nishonlanadi va radioaktivlikning mikdoriga karab, kerakli komponentni konsen­tratsiyasi aniklanadi. Radiaktiv nishon o‘rniga flyuretsent moddalarni ham nishon sifatida qo‘llash mumkin Ammo immunologik reaksiyalar samarasini oshirish nuqtai nazaridan, nishon sifatida ferment preparatlarini qo‘llash bir muncha afzalliklarga ega bo‘lib chikdi. Sababi bu holda metodni sezgirligi bir necha ming barobar oshadi. CHunki fermentlar blokkatalizatorlar bo‘lib, o‘z substratini maxsulotga aylanish reaksiyasini o‘ta yuqori darajada tezlashtirish qobiliyatiga egadir. Asosan ferment molekulalaridan nishon sifatida foydalanish o‘tgan asrning 60- yillarida taklif etildi. SHundan so‘ng esa, immunoenzim tahlili metodlariga asos solindi. Keyingi yillarda esa, ushbu yo‘nalish, ya’ni immunobiotexnologiya fani sifatida rivojlanib, taraqqiy eta boshladi va bu sohada katta yutuqlarga erishildi. Immunobiotexnologiyaning eng katta yutuqlaridan biri –bu itmmunoenzim tahlilini ishlab chiqilishidir. Ushbu tahlilning selektivligi, uning negizida bir kator yangi aniklash metodlarini vujudga keltirdi. Bu sohadagi asosiy yutuklar ferment -substrat va antigen-antitela, hamda makromolekulalar biologik spetsifikligiga asoslangan reaksiyalarni o‘rganish va ularning o‘ziga xos tomonlarini aniqlash tufayli qo‘lga kiritildi.

Turli antigenlarni va viruslarni diagnostika qilishda bir qator mmunologik testlar qo‘llaniladi. Viruslar – antigen sifatida bir necha xil antigen determinantlarga ega antigen hisoblanib, ularni hayvon organizmiga yuborganda, ularga karshi antitanalar hosil bo‘lishi kuzatiladi. Sababi viruslar, antigenlik hususiyati ega bo‘lgan, turli antigen determinantasi mavjud bo‘lgan mikroorganizm hisoblanadi. Viruslar nuklein kislotasini o‘rab turgan tashqi oqsil qavatidan tashkil topgan bo‘lib, antitana hosil kilishda sabab bulgan antigen determinantlari esa, odatda 3-----5 yo‘nalishga ega aminokislota qoldiqlaridan iborat bo‘ladi.

Kimyoviy tabiatiga ko‘ra antitanalar qon zardobi oqsillari hisoblanib, glikoproteidlar sinfiga kiradi va immunoglobulinlar deb yuritiladi. Qon zardobi oqsillarini boshqa oqsillardan farqi o‘laroq, har hil effektor funksiyali geterogen populyasiyalar hosil qilishidadir. Sun’iy immunizatsiyada hosil bo‘ladigan turli antitanalar – asosan 5 ta sinfga mansub bo‘lib, ular ko‘p holatlarda o‘ziga xos hususiyatlari bilan serologik testlarda muhim rol o‘ynaydi.

SHu vaqtgacha ishlab chiqilgan immunologik metodlar antigen va anti zardob oqsillari o‘rtasida bo‘ladigan munosabatlarga asoslanib, ushbu metodlarni bir qancha gruppaga bo‘lish mumkin. Birinchisi – bu antigenlarni o‘ziga xos antitanalar bilan pretsiptatsiyalanishiga ya’ni agar gelida /cho‘kishiga/ asoslangan metoddir. Boshka gruppa metodlari pretsipitatsiya reaksiyasiga asoslangan bo‘lib, ammo pretsepitatsiya antigen va antitelolarni agar poralaridagi diffuziyasidan so‘ng yuz beradi. Ushbu usulda elektr maydoni orqali diffuziya jarayonini tezlashtirish mumkin. Bir qator metodlar, agglyutinatsiyaga asoslangandir, ya’ni antizardob bilan /antitela/ antigenni o‘zaro “yopishishiga” asoslangandir. Hosil bo‘lgan agregatlarni oddiy ko‘z bilan (yoki bir muncha kattalashtirgan holda) kuzatish mumkin.

Pretsipitatsiya reaksiyasi. Eng birinchi va keng qo‘lamda qishloq ho‘jaligida qo‘llaniladigan metodlarlardan biri bu- tomchi metodi, hamda ammoniy – sulfat metodlaridir. Tomchi metodini amalga oshirish jarayoni da o‘simlikni tozalanmagan soki bir tomchi antizardob bilan buyum oynachasi ustida aralashtiriladi. Xloroplastlarga, hujayra devorlari – parchalari, mitoxondriyalar va boshka o‘simlik komponetlariga yopishgan virus zarralari shu virus antizardobi bilan spetsifik ravishda bog‘lanib, ko‘rinarli darajada pretipitat hosil qiladi. KMD tozalanmagan o‘simlik shirasi asosida olib borilgani uchun, yuqori sezgirlikka ega emasdir. SHuning uchun ham u faqat o‘simlik bargida yuqori konsentratsiyada to‘planagan viruslarni aniqlashda qo‘llaniladi. Ammo zarari katta bo‘lgan va bargda kam to‘planadigan viruslar uchun, masalan, VTM, XVKlar uchun bu metod yaxshi natija bermaydi. KMDning, ya’ni tomchi metodining boshqa bir usuli mavjud bo‘lib u halqapretsipitatsiya usuli deb ataladi. Ushbu virus o‘ziga xos antizardob bilan kontakda bo‘lganda pretsipetatdan iborat halqa hosil bo‘ladi. Xalqa hosil qiluvchi metod tez amalga oshishiga qaramasdan sezgirligi juda pastdir.

Ammoniy – sulfat metodi /ASM/ KMDga o‘hshash usul hisoblanipb, faqat ba’zi xalaqit qiluvchi xujayra shirasidagi ba’zi komponentlarni avval yo‘qotish kerak bo‘ladi. SHu sababli ushbu usulda avval hujayra komponentlarini yo‘qotish uchun xujayra shirasiga ammoniy sulfat bilan ishlov berilib, keyinchalik sentrifuga qilinish yo‘li bilan olib tashlanadi. ASM KMDga nisbatan juda ham katta afzalliklarga ega emas.

KMDga o‘hshash uning mikrovariantli reaksiya turi bu mikropretsipitatsiya usuli hisoblanadi (RMP). Bu holatda gidrofob yuzada reagentlar viruslar va antizardob (AS) aralashtiriladi, bug‘lanishni oldini olish uchun ustidan paradin moyi quyilib,, aralashtiriladi va ma’lum vaqt, ya’ni 24 soat davomida inkubatsiya qilinadi. SHundan so‘ng olingan natija baholanadi. Bu metodlarni sezgirlik daradasi I mkg/ml dan oshmaydi, reaksiya muddati bir necha soatdan bir necha sutkani tashkil etadi.

Diffuzion testlar – Ko‘zga ko‘rinadigan pretsipitatlarni hosil bo‘lishi uchun immunodiffuziya reaksiyasi (RID), ikki tomonlama diffuziya reaksiyasi (RDD), immunoelektroforez ( IEF) oson hamda sezgir testlar hisoblanadi. RIDni o‘tkazish uchun antigen bilan to‘ldirilgan agardagi o‘yiqchalardan foydalaniladi. O‘yiqchalar atrofidagi, ya’ni agar gelida hosil qilingan o‘yiqchalar antizardob bilan to‘ldiriladi. SHundan so‘ng ma’lum muddat inkubatsiya qilinadi (48 soat). Inkubatsiyadan sung agar geli maxsus bo‘yoq yordamida bo‘yalsa, hosil bo‘lgan pretsipitat chiziqlar hosil bo‘lishini kuzatish mumkin. Izometrik viruslar ancha oson diffuziya bo‘ladi va yaxshi farqlanuvchi chiziqlar hosil bo‘lishini kuzatish mumkin 0,75 % agar gelida X -ipsimon viruslar diffuziyasini oson amalga oshirish mumkin. Diffuziyani engillashtirish va mahsus pretsipitatlarni hosil bo‘lishini tezlatish uchun virus antigeni sifatida gidrolizlangan virus zarralari ishlatiladi. Buning uchun ba’zi kimyoviy moddalardan foydalanish mumkin. Masalan, piridin, pirrolidin, farmonid, mochevina, natriy dodetsilsulfat kabilar yoki ultratovush, termodenanuratsiya kabi fizik ta’sirlardan foydalanish mumkin. Natijada virusni to‘la dezgodatsiyasi qilish mumkin. Ushbu jarayondan so‘ng, virus kapsidining oligamerlari /D- protein/ hosil bo‘ladi va ular pretsepitatsiya reaksiyasini amalga oshiradi. Ko‘pgina holatlarda D – proteinlarning immunohimiyaviy o‘ziga hosligi birlamchi nativ virusnikidan farq qiladi. Natijada denaturatsiya bo‘lgan virus pretsepitatsiya chizig‘ini hosil qilmaydi. Ushbu holatni dezgodatsiya qilingan VSHI, XVK , BK kabi viruslarda kuzatish mumkin.

RDD da agar AS bilan shimdirilmaydi, pretsipitatni hosil bo‘lishi virus antigeni gamologik antizardoblar bilan to‘latilgan o‘yiqchalar orasida hosil bo‘ladi. YUqorida qayd etilgan metodlarda jumladan RID va RDDlar qo‘lanilganda ba’zi muammolar kelib chiqadi. Masalan, RIDning sezgirligi RDDdan ancha yuqoridir. Bu holat XVK virusi aniqlanganda yaxshi ko‘rinadi. RID usuli yordamida XVK virusini aniqlanish miqdori I,0 mkg/ml tashkil etsa, RDDda esa bu ko‘rsatgich 10mg/mlni tashkil etadi. XVK virusi D proteinini RID asosida va RDDi yordamida aniqlab, RMPka metodiga solishtirilsa, RMK ning ancha sezgirligini ko‘rsatganligi aniqlangan. Bunda RMPning sezgirligi 0,5mkg/mlni RIDniki – I,0 mkg/ml va RIDniki esa 10mkg/mlni tashkil etdi. Bu o‘rinda shuni qayd etish lozimki, yuqoridagi usullarning sezgirligi qator faktorlarga bog‘liq bo‘ladi. Bunda virus va antitela komponentlari muhim rol o‘ynaydi. YA’ni ularning tozalik jarajasi, ishlatilayotgan moddalar konsentratsiyasi, nospetsifik jarayonlar shular jumlasidandir.

Barcha reaksiya sharoitiga ta’sir etuvchi omillarni hisobga olgan holda, aniqlanayotgan antigen virusini aniqlanish darajasini 1 - 2 mkg/mlga ko‘tarish mumkin. Bunda ishlatilayotgan antizardob yuqori titrga ega bo‘lishi kerak. Ushbu usulga bir necha omillar ta’sir etishi mumkin. Masalan, o‘yiqchalar razmeri, ular orasidagi masofa, detergentning konsentratsiyasi va agarning tozalik darajasi shular jumlasidanlir.

YUqorida ko‘rsatilgan misollardan ko‘rinib turibdiki, RID va RDD yordamida turli antigenlarni, shu jumladan o‘simlik viruslarini serologik jihatdan tahlil qilish mumkin. 90mmli Petri likopchasida 500-600ta namunani joylashtirib, kerakli natijani olish mumkin.

Barcha immunodiffuzion testlarni amalga oshirish va testning aniqlik darajasi, antigen va antiteloni diffuziyalanishiga bog‘liq bo‘lib, diffuziyalanish qanchalik yuqori bo‘lsa, test natijasi shunchalik aniq bo‘ladi. Testni borishida paydo bo‘ladigan noaniqlik, nospetsifik reaksiyalarga bog‘liq bo‘ladi. YA’ni bunday holatda, ba’zida maxsus bo‘lmagan reaksiya turlari amalga oshib, yolg‘on musbat pretsepitatsiya zonalarini hosil bo‘lishiga olib keladi (komponentlarni denaturatsiyasi asosida hosil bo‘ladigan ba’zi komponentlar, shuningdek, turli “tikuvchi” va “yopishtiruvchi” agentlarni bo‘lishi).

Agglyutinatsiya reaksiyalari. (Lateks –test LT) YAna bir ancha keng tarqalgan testlar gruppasiga aggmotinatsiya reaksiyalariga asoslangan testlar guruhini kiritish mumkin. Agar birorta “olib yuruvchi tashuvchi”- (lateks, bentonit, bakteriya xujayralari, eritrotsit va hakozolar) AS bilan sensibilizatsiya qilingan bo‘lsa va tashuvchi gomogen suspenziyasiga virus solinsa, bunda har xil razmerli agregatlar hosil bo‘lishi kuzatiladi. Masalan, polistrol lateksga asoslangan agglyutinatsiya reaksiyasi yordamida fitoviruslar aniklangan. Bunda 0,31 mkm razmerli lateks zarrachalari immunoglobulin fraksiyasi bilan sensibillanadi. So‘ngra bu diagnostikumni bir tomchisi shisha plastinka yoki kapillyarda bir tomchi o‘simlik shirasi bilan aralashtiriladi, hamda maxsus aralashtirgichda chayqatiladi. Agar musbat reksiya bo‘lsa, lateks zarralari agglyutinatsiyasi kuzatiladi. Reaksiya natijasini oddiy ko‘z bilan yoki mikroskopni kichik ob’ektivida (kattalashtirilgan holatda) ko‘rish mumkin. Ushbu jarayonning amalga oshirish muddati ancha kam vaqtni ya’ni 10-60 minutni tashkil etadi. Lateks testni takomillashtirilgan formasi ham mavjud bo‘lib, u oltin, ya’ni tilla kabi sariq yaltiroq stafilokokkni A-oqsili asosida boradigan reaksiya turidir. Lateks-test reaksiyasida- lateks zarrasi A- stafilokok oqsili bilan, keyin esa antizardob bilan aralashtirilib, reaksiya qo‘yiladi. Bunda ushbu usul bilan ba’zi viruslar diagnostika qilinganda, uning sezgirligi 2-16 ga ko‘tarilishi aniqlangan. Bunda ushbu usulning sezgirligini oshishini quyidagicha izohlash mumkin. Birinchidan, lateks A oqsil bilan sensibilizatsiya qilinsa, oqsil unga yaxshi birikadi va uning birikish mikdori boshqa oqsillarga qaraganda ancha ko‘p miqdorni tashkil etadi. Ikkinchidan lateksga nisbatan, xaos bo‘lib joylashgan antiteloning aktiv markazlari tashqi tomonga yunalgan holatda joylashadi.

LT ning yukori sezgirligi, tezligi, past titrga ega zardoblarni qo‘llash mumkinligi LTni faqat laboratoriyada o‘tkaziladigan ilmiy tadqiqot ishlarida emas, balki, dala sharoitida olib boriladigan ba’zi ishlarda ham qo‘llash mumkin. Uning yordamida kartoshkani X, U viruslarini 4-10 minut ichida aniklash mumkin.

Bentonit flokulyasiyasi testi - /BFT/ spetsefik antitela bilan sensibillangan bentonitni virus zarrasi ishtirokida agglyutinatsiya bo‘lishiga asoslangan. Bentonit-oson gidratlanadigan alyumosilikat bo‘lib, suspenziya holatida, nospetsefik ravishda oksillirni biriktiradi. Uni sesibillash uchun suyultirilmagan antizardob, ya’ni sulfat ammoniy bilan cho‘ktirish natijasida olingan gamm-globulin fraksiyasi ishlatiladi. Reaksiyani amalga oshirish jarayoni, xuddi LTga juda o‘xshashdir. Ushbu metod asosida VTM tomatini halka mozaykasi, soya mozaykasi viruslarini toza preparatlari 0,3-1 mkg/ml gacha bo‘lgan miqdorini aniklash mumkin.

Noto‘g‘ri gemmaglmotinatsiya reaksiyasi /RNGA/ fitoviruslar aniklashda ancha kam qo‘llaniladi. RNGA odatda kapsid oksilida gemaagglyutini bor viruslarni aniklashda ishlatiladi. Odatda eritrotsit diagnostikum noto‘g‘ri usulda tayyorlanadi: eritrotsitni ustiga antitelalar polifunksiyali tikuvchi agentlar (gludar dialdegidi, formaldegid, xromxlori, tanin va boshqa moddalar) yordamida “tikiladi”. SHundan so‘ng unga aniqlanayotgan modda, ya’ni antigen solinadi va ma’lum muddat inkubatsiya qilinadi. Reaksiya jarayoni nihoyasiga etgandan so‘ng, natija tahlil qilinadi. Ushbu usul yordamida VSHMYA virus preparati aniklangan bo‘lib, uning sezgirligi 0,01 mkg/mlni tashkil etgandir. Bundan shunday xulosa qilish mumkinki, bir qator viruslar uchun RNGA, LTga qaraganda 8-40 marta sezgirroqdir.

Sensibillash uchun noorganik va polimeor moddalardan tashqari, ba’zi mikroorganizm xujayralari ham ishlatiladi. Eng keng ko‘lamda aktivligi yo‘qotilgan tillasimon stafilakokk ishlatiladi. Bunda antizardob va bakteriya xujayralari aralashtirilib, so‘ngra ushbu aralashmaga antigen qo‘shilsa, yuqori tezlikda agglyutinatsiya reaksiyasi yuz beradi. Avallo, bu metod mikroorganizmlarni serotiplarga ajratishda qo‘llanilgan bo‘lsa, keyinchalik esa, fitoviruslarni diagnostika qilishda keng ishlatila boshladi.

Tillasimon stafilakokni muhim tomoni unda A deb ataluvchi oqsil modda mavjud. A- oqsil ajoyib xususiyatga ega bo‘lib, u immunoglobulin molekulalarini Fs-fragmenti bilan bog‘lanish xususiyatiga egadir, bunda antiteloni antigen bilan bog‘lanadigan faol markazi bo‘sh qoladi. Bu xususiyat faqat A oqsilga xos bo‘lmay, balki ko‘pgina mikroorganizmlar oqsillariga ham xosdir. Faqat ular etarlicha chukur o‘rganilmagan. A oqsil esa ancha yaxshi o‘rganilgan bo‘lib, etarli ma’lumotlar to‘plangan. Ushbu oqsil xujayra devorini tashqi qavatida joylashgan, tekis tarqalgan va immunoglobulinlar bilan /antizardob AS/ boglanishi ancha osondir. Bundan tashqari A- oqsilini toza preparati olingan bo‘lib, uning strukturasi va fizika – ximyoviy xususiyatlari o‘rganilgan. Reaksiya jarayonida antigen bilan antiteloni o‘zaro birlashishiga A- oqsil to‘sqinlik qilmaydi. Bunda reaksiya davomida Fs- fragmentini A- oksiliga nisbatan “spetsifiklikligi”- moyilligi yanada oshadi.

A- oqsilining bunday xususiyati va uning mikrobiologik diagnostikada keng ishlatilishi, shuningdek, fitoviruslarni diagnostika qilishda, yana viro-bakteriya agglyutinatsiya /ABV-test/ metodini yaratilishida turtki bo‘ldi. ABV-testning mohiyati shundan iboratki, bunda 10%li stafilokokk suspenziyasi virus antizardobi bilan bilan aralashtiriladi. So‘ngra diagnostika qilinayotgan eritmaning bir tomchisi, masalan, virus preparatining bir tomchisi buyum oynachasi ustida aralashtiriladi. Ma’lum muddat o‘tgandan so‘ng, esa agregatsiya bo‘lgan stafilokokklarni opok cho‘kmasi hosil bo‘lganligini oddiy ko‘z bilan kuzatish mumkin bo‘ladi. ABV- test yordamida viruslarni 0,2-0,5mkg/ml gacha aniklansa bo‘ladi. Albatta ushbu usul RIA, FIA va IET usullarining sezgirligidan ancha pastdir, ammo tahlilni ancha oson amalga oshirish mumkinligi, uni amaliyotga keng tadbiq etish imkonini beradi. Ushbu metod iktsodiy jihatdan qulay bo‘lib, ko‘p mablag‘ talab etmaydi. Bundan tashqari AS ni 100-200 marta suyultirib ishlatilganda ham, yaxshi natija olish mumkin. SHuning uchun ushbu usul hujayrada juda kam to‘planadigan viruslarni aniqlashda keng qo‘llaniladi. Bu o‘rinda shuni qayd etish lozimki, yuqorida qayd etilgan diffuzion, agglyutinatsion usullar sezgirligi jihatidan past hisoblanib, hozirgi kun talabiga javob bermaydi. SHu sababli, sezgir, qulay, zamon talabiga javob beradigan metodlarni ishlab chiqish muhimdir. Hozirgi kunda juda katta sezgirlikka ega metodlarni ishlab chiqishda, immunologik reaksiyalarni amalga oshirishda nishon sifatida radioaktiv izotop modda, fluoressent- zont, DNK- zont, shuningdek, ferment molekulalaridan foydalaniladi. Ayniqsa, ferment molekulalari nishon sifatida keng qo‘laniladi. Sababi, ular bir necha qulayliklarga ega bo‘lib, har tomonlama afzal biologik faol moddadir. Avvalo ular inson organizmi va atrof- muhit uchun hech qanday xavf tug‘dirmaydigan moddalar hisoblanib, yuqori fermentativ faollikka ega bo‘lganligi uchun, reaksiya jarayonini 10¹² tezlashtirishi mumkin. ²⁴

1Immunologik reaksiya jarayoni qanday amalga oshadi?.

2.Imun kompleksning hosil bulishi qanday qonuniyat asosida kechadi?

3.Polivalent antigenlar haqida tushuncha bering

4.Flyuretsent moddalar yordamida antitanani nishonlashni tushuntiring

5.Ferment yordamida antitanani nishonlash qanday amalga oshadi?

1.In Vivo sharoitida antigen va antitana reaksiyalari

2.Antigen va antitana larni miqdoriy tahlili

3.Tahlilni gomogen usuli .

4.IET ni geterogen usullari haqida tushuncha

Immunoenzim tahlili 60-yillarni o‘rtalarida vujudga kelib, avval, gistologik preparatda antigenni identifikatsiyalash, keyin esa immunodiffuziya va immunoelektroforez testlarida pretsipitatsiya chiziqlarini aniqlashda qo‘llanilgan. Bundan tashqari biologik suyuqliklarda antigenlar va antitelalarni miqdoriy tahlili uchun ishlatila boshlangan. Metodni geterogen usulini ishlab chiqishda E.Engvall va R.Perlmann, shuningdek, ularga bog‘liq bo‘lmagan ravishda V.K Van Veemen va A.SHuurslar 1971 yili o‘z tadqiqot ishlarini olib borganlar va ushbu usulning muallifi hisoblanadilar. 1972 yili esa E.K. Rubenshteyn o‘z shogirdlari bilan IET gomogen usulini ishlab chiqishga muvaffaq bo‘lganlar. Ushbu IET lari usullarini ishlab chiqqan mualliflar aynan, o‘z tadqiqot ishlarida va shuningdek, amaliyotda IET talablariga javob bera oladigan ferment molekulalarini va ularning kofaktorlarini nishon sifatida qo‘llab, kon’yugat olish mumkinligini isbotlaganlar. Sababi yuqorida aytib o‘tilgandek, fermentlar o‘z substratlari ishtirokida kimyoviy reaksiyani I0⁶-10¹² marotaba tezlashtirar ekanlar, shu bilan birga ular antigen va antitelalar o‘rtasida bo‘ladigan immunokimyoviy jarayonlarning sezgirligini ham bir necha bor oshirib, aniqlanishi kerak bo‘lgan modda miqdorini (pkM) juda kichkina qiymatlarda aniqlash uchun kerakli fermentativ reaksiya turini katalizlash imkoniyatga ega moddalar hisoblanadilar. SHuning uchun immunokimyoviy reaksiyalarda, faqat ferment molekulalari emas, balki ularning kofaktorlari ham maxsus markerlar sifatida IET ning turli usullarida keng qo‘llanilmoqda.

Hozirgi vaktda immunoenzim tahlili (IET) usulining xilma-xil turlari ishlab chiqilgan. IET turli xil moddalarni aniqlash uchun keng qo‘llaniladi. Jumladan, dorivor preparatlarni, gormonlarni, antitelalarni, virus va bakterial antigenlarni, oziq-ovqat toksinlarini, fitotoksinlarni, narkotik moddalarni, hamda sifiliz, malyariya taksoplazmoz, alveokok, qizilcha va gelmintlarni, salmonellezni va kasallik tug‘diruvchi mikroorganizmlarni diagnoztika qilishda keng qo‘llaniladi. Modomiki, IET antitelalarni aniqlashda ham qo‘llanilar ekan, bu esa o‘z navbatida ko‘p kasalliklarni boshlanish bosqichida oldini olish va serodiagnostika qilish imkoniyatini yaratadi.

IETning asosiy mohiyati shundan iboratki, biokatalizator molekulasi reaksiya ketadigan zonada antigen bilan yoki antitela bilan bog‘langan shaklda bo‘lishidir. Antigen yoki antitelaning ferment molekulasi bilan bog‘langan shakli kon’yugat deb yuritiladi. IETni o‘tkazish vaqtida antigen antitana molekulasi bilan bog‘langandan so‘ng, ushbu kompleksni aniqlash uchun, fermentning substrati kiritiladi va reaksiya natijasida xosil buladigan mahsulotlar aniqlanadi.

SHuni aytib o‘tish lozimki, IETda fermentativ reaksiyani deteksiya qilish hosil bo‘lgan mahsulotni aniqlash bilan chegaralanmay, balki reaksiyasi natijasida rangli o‘zgarish, issiklik ajralish yoki yutilish, flyuretsensiya, paramagnit xususiyatlarni yoki boshka fizik-kimyoviy parametrlarni o‘zgarishi natijasida aniqlashni amalga oshirish mumkin.

Hozirgi kunda qo‘llaniladigan immunoenzim tahlili metodlarining umumiy ko‘rinishini sxematik ravishda quyidagicha izohlash mumkin.

IETni o‘tkazishda immun komponentlarning tozalik darajasi muhim ahamiyatga egadir. Sababi IETning sezgirlik darajasi komponentlarga va ayniqsa unda nishon sifatida qo‘llanilayotgan ferment molekulasi faolligiga bog‘liq bo‘ladi. Antitela serologik jihatdan faol va antigenga nisbatan titri yuqori bo‘lishi uchun, antigenning immunogenlik xususiyati yuqori bo‘lishi bo‘lishi kerak. SHunda antigen kerakli antitelalarning uzluksiz sintezini amalga oshirishga qodir bo‘ladi. IETda ishlatilayotgan immun komponentlarning titri yuqori bo‘lmasa, ushbu oqsillar modifikatsiyadan so‘ng denaturatsiyalanishi hisobiga inaktivlanadi.

Ayniqsa tokcinlar holatidagi oqsil tabiatli ba’zi moddalar, viruslar, ba’zi mikroorganizmlarni faol bo‘lmagan shtammlarini antigen sifatida olish kon’yugatlarni kimyoviy sintezida ijobiy natija bermaydi. SHu sababli antigen antitelalarni ma’lum manbadan ajratish va ularni tozalash va kalibrovka egri chiziklarini tayyorlash talab etiladi. Antitelalarni tozalashda biosferik xromatografiya qo‘llaniladi. Buning uchun avvalo biospetsifik va immunosorbentlar sintezlash kerak. Ushbu immunosorbentlar IETning geterogen variantlarini ishlab chiqishda kerak bo‘ladi.Immunosorbentlar olish uchun mmobilizatsiyalangan antigenlarni sintezlash zarur. CHunki geterogen IET qattiq tashuvchi yuzasida olib boriladi.

Immunoenzim tahlilining geterogen usuli qattiq fazada o‘tkaziladi.

1.In Vivo sharoitida antigen va antitana reaksiyalarini tushuntiring

2.Antigen va antitanalarni miqdoriy tahlil qilishda nimalarga e’tiborni qaratish kerak?

3.Tahlilni gomogen usuli nimalar bilan boshqa tahlil usullaridan farq qiladi?

4.IET ni geterogen usullari haqida tushuncha bering

Mavzu- 7: Immun reaksiyalarning o‘ziga xosligi

Reja:

1.Sendvich usulini mohiyati va qo‘llanilishti

2.Fermentlar va ularning substratlari

3.Ekranlashtirish asosida antitanani miqdoriy tahlili

4.Raqobatlashish usuli asosida antigenlar tahlili

5.Effektorlar va ularning xususiyatlari

2-antigenlarni aniqlash

Antigen va antitanalarni turli tashuvchilarga bog‘lash imkoniyatini mavjudligi, immobillangan immun komponentlarni immunoenzim tahlilining geterogen usullarida keng ishlatilish mumkinligini ko‘rsatdi.

Monoklonal antitanalarni olish texnologiyasini ishlab chiqilishi esa, IET ni keyingi rivojlanishiga xizmat qildi, bu esa o‘z navbatida uning spetsifikligi, sezgirligini va aniqlash darajasini yanada oshirish imkonini berdi.

IET nazariy jihatlari zamonaviy immunoximiya, immunobiotexnologiya va enzimologiya ma’lumotlariga, shuningdek antigen-antitanalar o‘rtasida boradigan immunologik reaksiyalarning reaksiyasining fizik-kimyoviy qonuniyatlariga va analitik kimyoni asosiy prinsiplariga asoslangan. IETning sezgirligi va uni o‘tkazilish jarayoni bir necha asosiy omillar bilan jumladan, antigen-antitana reaksiyasini kinetik, termodinamik xarakteristikalariga, reagentlar nisbati, fermentning faolligi va uni deteksiya qilish metodlarining xususiyatlariga bog‘liq bo‘ladi. Umuman olganda, antigen-antitana o‘rtasidagi reaksiyani sxematik tarzda quyidagicha tavsiflash mumkin:

[AT]+[AG]↔[ATAG]

Pastmolekulyar birikmalardan va yuqori murakkabroq tuzilishga ega virus va bakteriyalargacha bo‘lgan xilma-xil tadqiqot ob’ektlarini IET yordamida aniqlash, ushbu metodni nihoyatda ko‘p variantlarini ishlab chiqilishini taqozo etadi.

IETda kon’yugatlarni sintez qilishda tahlil uchun har tomonlama mos fermentlardan foydalaniladi. Bunda nishon sifatida qo‘llanilishi mumkin bo‘lgan fermentlar eritma tarkibida o‘zining faolligini namoyon qilishi kerak. Sababi, fermentning fermentativ faolligi qancha yuqori bo‘lsa, sezgirlik ham shuncha oshadi. SHu sababdan, IETda nishon sifatida qo‘llaniladigan fermentlarga quyidagi talablar qo‘yiladi:

6. 
   Kichik konsentratsiyadagi molekulalarni aniqlash uchun qo‘llaniladigan ferment yuqori spetsifiklikka va fermentativ faollikka ega bo‘lishi kerak;
   
7. 
   Nishon sifatida qo‘llaniladigan fermentlar kimyoviy modifikatsiyadan so‘ng, yuqori fermentativ faollikka ega bo‘lishi kerak;
   
8. 
   Fermentlar antigen va antitanalar ta’sirida, shuningdek, ular bilan kimyoviy bog‘ hosil qilganlarida ham, o‘z barqarorliklarini yo‘qotmasligi zarur;
   
9. 
   ferment faolligini aniqlash usuli sodda va yuqori sezuvchanlik darajasiga ega bo‘lgan usul bo‘lishi kerak;
   
10. 
    ferment preparati rangli mahsulot berishi kerak. Sababi IFAni miqdor, sifat jihatdan tahlil qilish mumkin.
    

Substratni tanlash birinchi navbatda nishon sifatida ishlatilayotgan ferment bilan belgilanadi, chunki ferment-substrat reaksiyasi yuqori spetsifikdir.

Substratga asosiy talablar:

• 
  fermentni kon’yugatda aniqlashda metodni yuqori sezgirligini ta’minlash;
  
• 
  ferment-substrat reaksiyasining aniq ko‘rinadigan (masalan, bo‘yalgan) mahsulotlarini hosil bo‘lishi;
  
• 
  substrat xavfsiz, arzon va ishlatish uchun qulay bo‘lishi kerak²⁶