IV. AMALIY MASHG‘ULOTLAR UCHUN MATERIALLARI

IV. AMALIY MASHG‘ULOTLAR UCHUN MATERIALLARI

Antigen va antitela eritmalari qarama-qarshi tomonda joylashgan, chuqurligi qarayib 1,5 mm keladigan chuqurchalarga quyiladi. CHuqurchalarning joylashuvi va ular orasidagi masofa shisha ostiga quyilgan trafaretga qarab aniqlanadi. Bu tajribalarni standartlashtirishga imkon beradi. Antigenlar va antitelalar gelga diffuziyalanadi, bir-biri bilan uchrashib , qarama-qarshi joylashgan chuqurchalar orasida pretsipitatsiya chiziqlarini hosil qiladi. Pretsipitatsiyaga zarur bo‘dgan vaqt asosan antigen va antitelalari bor chuqurchalar orasidagi masofa bilan o‘lchanadi. Umuman chuqurchalar orasidagi masofa 6 mm dan oshmasligi kerak. Agar hamma chuqurchalar bir hil kattalikda bo‘lsa, ular orasidagi masofa chuqurchaning ikki diametridan oshmasligi lozim.

Diffuziya sekin o‘tadigan katta molekulyar ( mol.og‘irligi > 1000000, massalan, Ig m) tekshirilganda pretsipitatlarning hosil bo‘lishiga 24 soatdan ko‘ra ko‘p. vaqt ketadi.

Harorat oshganda reaksiya tezroq o‘tsada, lekin ba’zan bunda pretsipitatsiya yomonlashadi. CHuqurchalar o‘lchamlarini shunday tanlash mumkinki, bunda reaksiyaga kirishadigan moddalarning nisbati optimal ( eng to‘g‘ri)., pretsipitatsiya chiziqlari esa ravshan bo‘lishi kerak. Agar nisbiy Konsentratsiyalar durust tanlanmasa, immun komplekslar eruvchanligigacha qolaveradi va pretsipitatsiya chiziqchalari umuman ko‘rinmaydi, yoki xira va bilinmaydigan bo‘lib qoladi. Antigen va antitelalarning bir necha xil konsentratsiyalari (suyultirilganlari) olinganda eng yaxshi natijalarga erishiladi.

Zardobga qarshi moddalar surtilmagan xollarda antigenlar konsentratsiyasi odatda qariyib 1 mg/ml ni tashkil qilmog‘i zarur. Tegishlicha suyultirilgan pretsipitatsiya xossalari yaxshi bo‘lgan antitelalarni ishlatib turib 5mkg/ml konsentratsiyali individual antigenlarni aniqlasa bo‘ladi. I – rasmda foydasi tegishi mumkin bo‘lgan chuqurchalarning joylashish misollari keltirilgan. CHuqurchalar o‘lchamlari masshtabga (katta-kichiklikka) qarab berilgan. Bir-biriga nisbatan muayyan holda joylashgan chuqurchalarni qirqib olish uchun mo‘ljallangan kommersiya perforatorlari ma’lum.
.2. Usulning qo‘llanilishi.

1. Pretsipitatsiyalovchi xossalarga bo‘lgan muhim birlamchi test (sinov) , taxminiy titr va eruvchan antigenlarga nisbatan antitelalarning spetsifikligi.

2. Antitelalar spetsifikligini aniqlashning standart ( qabul qilingan) usuli.

3.Antigenlarning bir xil bo‘lishini aniqlash testi, antigen tozaligini va antigenlarning molekulalar orasidagi o‘zaro ta’sirini aniqlash.

4. Antigen konsentratsiyasini taxminan aniqlash.
3.Gellarni tayyorlash.

1. Agaroza saqlanadigan flakon qopqog‘ini ochib, flakonni agaroza tamomila eriguncha qaynab turgan suvga qo‘yib qo‘yiladi.

2. Gelbond ning kichik qoshiqchasi ishlatilganda plenka xo‘llanadi va uni xo‘llanmaydigan tomonini shisha plastinkaga tekkizib qo‘yiladi. Bu plastina ish stoliga o‘rnatiladi va plastinaning gorizantal holatda joylashganligiga ishonch hosil qilinadi.

3. Plastinaga 9,6 ml miqdordagi erigan agaroza surtib qo‘yiladi, agaroza bunda plastina bo‘ylab markazdan chetlariga yoyiladi ( zarur bo‘lganda agarozaning tomizg‘ichning uchi orqali yoyilishiga yordam beriladi va gelda pufakchalarning qolmasligiga ishonch hosil qilinadi).³⁴

Agglyutinatsiya – suyuqlikdagi zarrachalar (bakteriyalar, eritrotsitlar va boshqa xujayra elementlari)ning bir biriga yopishib, g‘ujlanib qolishi.

1. Immunobiotexnologiya fani nima?

2. Immunologiyaning dolzarb muammolari qaysi soxada ishlatiladi?

Amaliy mashg‘ulot №2 Antitelalarning spetsifikligi.

Maqsad: antitelalar spetsifikligini o‘rganish.
Ishni bajarish uchun namuna

Geldagi qo‘shaloq diffuziya – bu molekulalarning orasidagi antigen bog‘lanishlari va ning antiqa va oddiy usulidir. Bu usulning ikkita kamchiligi bor: kam sezuvchanlik va chiziqlarni aniqlashda chiziqlar bir birini ustiga tushib qolishi mumkin.

4-rasm.
Markaziy chuqurchada antigenlar aralashmasi bo‘lib, u juda bo‘lmaganda ikkita komponentdan iborat, bularning biri tekshiriluvchi antiteloning nishoni (Y) dan tshkil topgan. CHuqurcha 6 ga standart xolda tozalangan antigen bo‘lgan chuqurchalar orasidagi pretsipitatsiya chiziqlari standart antigen Y va aralashmada saqlagan antigenning o‘xshash ekanligidan dalolat beradi. Tekshirilayotgan zardobga qarshi modda 1 (chuqurcha 4) da xam antigen Yga nisbatan antitelalar bo‘lib, to‘la o‘xshashlik reaksiyasini berib qo‘shimcha pretsipitatsiya chiziqlari bo‘lmaydi. Lekin tekshirilayotgan antitela 2 (chuqurcha 3) aralashmada saqlagan ikkinchi antigenga nisbatan spetsifik bo‘lgan antitelalar saqlanadi. Antigen X ikkinchi tekshiruv antitela bilan aniqlanadi, bu modda chuqurcha 1 ga joylashtirilgan tozalangan antigen X va U xosil qilgan pretsipitatlar chuqurcha 3 qarshisida birlashadi, lekin chuqurcha 2 va 3, shuningdek, chuqurcha 3 va 4 orasida pretsipitatsiya yoylarining qo‘shilmasligi ko‘rinib turganidek, pretsipitat ikkita mustaqil sistemalarga mansub bo‘ladi. Standart antigenlarsiz va tekshiruv antitelalarsiz xam shuni faraz qilish mumkinki, bu antigenlar qisman o‘xshashlikka ega emas, chunki pretsipitatsiya chiziqlari pixlarni xosil qilmaydi.³⁵

1. Pretsipitatsiya nima?

2. Antigen va antitanalarni ishlab chiqarishining dolzarb muammolari qaysi soxada ishlatiladi?


Amaliy mashg‘ulot №3

Aniq hal etish qobiliyati va sezuvchanlik
Ishni maqsad: diffuziya usullari bilan tanishish, usulning qo‘llanilishi xaqida tushunchalarga ega bo‘lish.

Ishni bajarish uchun namuna

Ichki standartlar ishlatilsa, radial diffuziyaning natijalar aniqligi yoki qayta ishlab chiqarilishi juda oshadi. U xolda tasodifiy xatolar plastinalar doirasidagi noaniqliklarda iborat bo‘lib, bular ning asosiy sabablari – aralashma va namunalar kiritilishining noaniqligidir. Tajriba organ sari shunday natijalarga erishish mumkinki, bunda xato ko‘p deganda 5 foizni tashkil etadi. Xatoni pretsipitatsiya xalqalari diametrlarining parallel joylashgan chuqurchalar atrofida tarqalganligini o‘lchab aniqlasa bo‘ladi. Bundan tashqari, xatolar muntazam olinmaganligida kalibrli egri chiziqqa xam namoyon bo‘ladi. ³⁶

Agglyutinatsiya – suyuqlikdagi zarrachalar (bakteriyalar, eritrotsitlar va boshqa xujayra elementlari)ning bir biriga yopishib, g‘ujlanib qolishi.

1. Immunobiotexnologiya fani nima?

2. Immunologiyaning dolzarb muammolari qaysi soxada ishlatiladi?


Amaliy mashg‘ulot №4

IMMUN ELEKTROFOREZ USULLARI.
Ishni maqsadi: elnktroforetik migratsiyasi, lateral diffuziya, manfiy zaryadlangan molekulalar antitelalar saqflovchi gel,

Ishni bajarish uchun namuna

Ushbu usullarda agarozada keyinchalik gelda immunpretsipitatsiya bo‘ladigan anttigenlarning elnktroforetik migratsiyasi ( ko‘chishi) sodir bo‘ladi. Birinchidan, jarayon natijasida antigenlar aralashmasining qisman bo‘linishi sodir bo‘ladi, chunki ularning geldagi kuo‘chishi mazkur rN i dagi bufer aralashmasining umumiy zaryadiga bog‘liq bo‘ladi. Bundan tashqari, manfiy zaryadlangan molekulalar antitelalar saqflovchi gelga tez ko‘chadi, bu pretsipitatsiyani tezlashtirib, lateral diffuziyani deyarli bartaraf etadi.

1.Immunelektroforez (IEF)

Agarozali gel plastinasida chuqurchalar va ular orasida joylashgan egatchalar qirqib olinadi.CHuqurchalarga antigenlar eritmalari qo‘yiladi va agarozaga qarma-qarshi tomondan pilikchalar qo‘yiladi, pilikchalar agarozani ikki rezervuarda elektrodli bufer bufer bilan birlashtiradi. Tok ulangandan keyin antigenlar chuqurchalardan gel bo‘ylab ko‘cha boshlaydi va ajralib ketdi. Elektroforez tugashi bilan antigenlarning o‘xshashligini aniqlasa bo‘ladi.Interpretatsiya natijalari geldagi diffuziya usullaridagi kabidir.

.2. Qo‘llanilishi.

Immunelektroforez birinchi navbatda antigenlarning sifatini va antitelalar psetsifikligini aniqlash usulidan iborat.

1. Antigenlar. Usul quyidagi hollarda qo‘llaniladi: 1)aralashmaning antigen tarkibini aniqlash uchun – bu, xususan, antigenlarni tozalashda muximdir. 2) alohida (individual) antigenlarning geterogenligini va gomogenligini taxlil qilish uchun

2. Antitelalar. Antitelalar spetsifikligini aniqlashda ishlatiladigan odatdagi test. Zardobli oqsillarning ja’mi pulasiga qarshi bo‘lgan moddalar tekshiruv sifatida ta’sirchan hisoblanadi.

3. Usulni qayta ishlash.

1. Geldagi diffuziya testi singari agarozali plastinalar tayyorlnadi.

2. Plastina trafetga joylashtiriladi, plastinaning ikkala tomonidan metall chizg‘ich uchun ikkita taglik joylanib, chizg‘ich bo‘yicha uchi o‘tkir bo‘lgan skalpel ( keskich) agatchalar chegaralari qirqiladi.

3. Elektroforez uchun kamera rezervuaarlariga bufer qo‘yilib, sovituvchi plastina zmeevigiga suv quyiladi.

4. Antigenlar chuqurchalarga quyiladi, bir chuqurchaning oldidagi gel satxiga ega bromfenol ko‘ki kristalli joylashtiriladi.

5. Kamera qopqoq bilan yopiladi (zmonaviy kameralarda kontakt ayirgichlari xavfsiz bo‘lishi uchun qopqoqda bo‘ladi). Qutblikka rioya qilib (anod plastinaning o‘ng chekkasiga ulanadi) kameraga simlar ulanadi.

6. Bormfenol ko‘kining anodga qarab ko‘chishiga ishonch hosil qilinadi. rN 8,6 ga teng bo‘lganda uning ko‘chish tezligi soatiga qariyib 4 sm ni tashkil etishi lozim. Qopqoqni ochishdan va plastinani ko‘zdan kechirishdan oldin albatta tok manbai o‘chiriladi. Bo‘yoqchi agatcha qirg‘og‘iga surilganda elektroforez tugatiladi.

7. Gelni darxol chuqur bo‘lmagan nam kameraga ko‘chirilib, tekis stolga joylanadi. Egatchalarnga qariyb 150 ml tegishli ziddizardoblar quyiladi va kamera qopqoq bilan berkitiladi. Zardob gelga tushmagunicha kamerani siljitmang ( masalan, kamerani sovutkichga qo‘ymang).

8. Pretsipitatsiya reaksiyasi o‘tishi uchun gellar tuni bo‘yi 4⁰ S da qoldiriladi. Agar reaksiya xona xaroratida o‘tkazilsa, gel bir necha soatdan keyin tekshiriladi va zarur bo‘lsa reaksiya to‘xtatiladi, pretsipitatsiya yoylari hali ravshanligicha saqlangan daqiqagacha gel suv bilan yuvib tozalanadi. Nam plastinalarni egatchalarni suv bilan to‘ldirib yoyilgan yorug‘likda suratga olgan maqul. Plastinaning pastki shishali yuzasini glitserin bilan yog‘sizlantirish mumkin. Plastinalar yuvib tozalanadi, quritiladi va geldagi immun diffuziyani amalga oshirgandagi kabi bo‘yaladi. Geldan zardobli oqsillarni olib tashlash uchun uni yaxshilab tozalab yuvish kerak. Antitelalar sifatida zardobning Ig G fraksiyasi ishlatilganda oqsillarning fon bo‘yalishi kamayadi.
Nazorat uchun savollar:

1. Immunobiotexnologiya fani nima?

2. Immunologiyaning dolzarb muammolari qaysi soxada ishlatiladi?

«ASSESMENT» texnikasi

Mazkur metod talim oluvchilarning bilim darajasini baholash, nazorat qilish, ozlashtirish korsatkichi va amaliy konikmalarini tekshirishga yonaltirilgan. Mazkur texnika orqali talim oluvchilarning bilish faoliyati turli yonalishlar (test, amaliy konikmalar, muammoli vaziyatlar mashqi, qiyosiy tahlil, simptomlarni aniqlash) boyicha tashxis qilinadi va baholanadi.

3-jadval. «ASSESMENT» usulining nazorat shakli.

Test	Qiyosiy tahlil
Simptom	Amaliy konikma

Keys-stadi usuli

Keys-stadi inglizcha case - anik vaziyat, study - talim sozlarining birikishidan hosil qilingan bolib, aniq vaziyatlarni organish, tahlil etish va ijtimoiy ahamiyatga ega natijalarga erishishga asoslangan talim metodidir.

Hozirgi kunda Bosh ilmiy-metodik markaz portalida taqdim etilgan «Innovatsion talim texnologiyalari» moduliga oid materiallar va taqdimotlarda Keys-stadi usulini amalga oshirish bosqichlari quyidagicha belgilangan:

5. 
   Keys bilan tanishuv (individual)
   
6. 
   Asosiy muammoni (oquv muammosini) ajratib olish va organish (individual va kichik guruhlarda)
   
7. 
   Goyalar yigish va muammoning echimini izlash (kichik guruxlarda)
   
8. 
   Keys echimi uchun taklif etilgan goyalarni taqdimoti, tahlil va baholash (oqituvchi va kichik guruhlar)
   
9. 
   Keys echimi va tavsiyalar (oqituvchi, kichik guruhlar va individual)
   

Raketali immunoforez va immun pretsipitatsiya kombinatsiyasi qoidasini yanada rivojlanishi natijasida ishlab chiqilgan. U monospetsifik antitela bilan bo‘lgan reaksiyada individual antigen konsentratsiyasini tez baxolash imkonini beradi.

Individual antigenlar gel asosida joylashgan chuqurchalardan tarkibida spetsifik antitelalar saqlagan agarozaga ko‘chadi. Maxsus sharoitlar yordamida antigenning anodga qarab ko‘chishi va antitelalarning bog‘langani sari pretsipitatsiyaning o‘tkazilgan yoylari (raketalari) xosil bo‘ladi. Raketalarning balandligi antigen konsentratsiyasiga proporsionaldir. Agar plastinaga standart anigenning bir qancha aralashmalari surtilgan bo‘lsa, no’malum (tajribalari) namunalarning konsentratsiyasini aniqlash oson, bunda ular standart egi chiziqlari bilan solishtirib ko‘riladi. Aralashmalaridagi individual antigenlarni aniqlash uchun geldagi monospetsifik antigenlarni aniqlash uchun gelda monospetsifik antitelalar bo‘lishi zarur. ³⁷

Tayanch so‘zlar va iboralar:

Agglyutinatsiya – suyuqlikdagi zarrachalar (bakteriyalar, eritrotsitlar va boshqa xujayra elementlari)ning bir biriga yopishib, g‘ujlanib qolishi.

1. Immunobiotexnologiya fani nima?

2. Immunologiyaning dolzarb muammolari qaysi soxada ishlatiladi?


Amaliy mashg‘ulot №6 Kesishma imunno elektroforez.
Ishni maqsadi: usulning qoidasi va qo‘llanilishi usullari

Ishni bajarish uchun namuna

Mazkur usulda birinchi bosqichda bir yo‘nalishda antigenlarning eletroforetik ajratilish va boshqa yo‘nalishda (90 burchak ostida), ikkinchi bosqichda raketali IEF koidasi ko‘zda tutiladi. Ajratilgan antiegnlar polispetsifik antitelalari bo‘lgan agarozaga ko‘chib raketalardan bir manzarani xosil qiladi. Usul antgenlar tarkibini teshirishi uchun katta analitik axamiyatga, bundan tashkari miqdoriy xisoblashlarning ba’zi bir xossalariga ega bo‘ladi. U anodga ko‘chadigan antigenlar tozaligini shuningdlek antitelalar spetsifikligini testlash uchun juda foydalidir.yu antitelalar saqlovchi, lekin pretsipitatlar xostil qilmaydigan gelga kiruvchi xar kanday oqsillarni geldan xalos etish mumkin, bunda elektroforez pritsipitatlar geldan anod tarafidan chiqib ketmaguncha davom ettiriladi. SHunday qilib. Ushbu usul antigen va antitelo kompleksini tozalash uchun ishlatish va uchliklardan immunlash uchun foydalanish mumkin. Bu boshqa usullarda tozalash qiyin bo‘lgan ko‘p sonli antigenlarga yo‘l ochib beraladi. Plastinarlardagi antigen uchliklarini ma’lum bo‘lgan standartlar bilan solishtirib, antigen aralashmalarining miqdorini baxolash mumkin bo‘ladi. Bu xususan kasallikda zardob tarkibining o‘zgarilshalirini aniqlashgan imkon beradi. Masalan: komplementning uchinchi komponentini faollashtirib (fermentativ parchalinish) individual oqsillarning o‘zgarishlarini va boshqa oqsillar proteolizinni kuzatish mumkin. Usuldan gelga ikkinchi bosqichni amalga oshirish uchun kiritilgan spetsifik antiteloni tekshirish uchun foydalanish mumkin.

Agglyutinatsiya – suyuqlikdagi zarrachalar (bakteriyalar, eritrotsitlar va boshqa xujayra elementlari)ning bir biriga yopishib, g‘ujlanib qolishi.

1. Immunobiotexnologiya fani nima?

2. Immunologiyaning dolzarb muammolari qaysi soxada ishlatiladi?

Amaliy mashg‘ulot №7 Muqobil imMunno elektroforez.

Maqsad: usulning o‘ziga xosligini ko‘rib chiqish.

Ishni bajarish uchun namuna

rN 8,6 bo‘lganda rN qiymati antitelolardagiga qaraganda kattaroq bo‘lgan antigenlar yuqori elektr endosmotik xossalarga ega bo‘lgan gelda turib, qarama qarshi chuqurchadan katodga siljiydigan antitelolarga qarab juda tez siljiydigan anodga tomon ko‘chadi. Bu xodisadan foydalanish antigenlar va antitelalar bor (ular tegishli proporsiyalarda qo‘yilgan taqdirda) chuqurchalar orasida pretsipitatsiya chiziqlarini tezlik bilan olish imkonini beradi. Muqobil IEF- antigenlarini xam antitelolarni xam aniqlashning eng sezuvchan va tezkor usulidir. Bu usul fiziologik suyukliklarda yuqumli antigenlarni (masalan, gepatit V virusi antigenlarini) zardobli oqsillar konsentratsyaisining o‘zgarishilarini (masalan a-fetoproteinni) aniqlash. va shuningdek anodga ko‘chadigan bir qator anitigenlarga nisbatan antitelollarni testlash uchun keng ko‘lamda qo‘llaniladi. Usulning sezuvchanligi 400 g/ml ga etadi.

Agglyutinatsiya – suyuqlikdagi zarrachalar (bakteriyalar, eritrotsitlar va boshqa xujayra elementlari)ning bir biriga yopishib, g‘ujlanib qolishi.

1. Immunobiotexnologiya fani nima?

2. Immunologiyaning dolzarb muammolari qaysi soxada ishlatiladi?


Amaliy mashg‘ulot №8 Vestern-blotting va antigenli bo‘lakchalarni immun kimyoviy bo‘yash.

Ishni maqsadi: usulning qo‘llanilish soxalarini o‘rganish

Ishni bajarish uchun namuna

Poliakrilamidli gelda elektroforez yordamida ajratib qo‘yilgan molekulalarni elektroforetik tarzda nitrotsellyulozani membranaga ko‘chirish mumkin, bunda molekulalar ana shu membrana bilan birikib, elektrofonetik bo‘linish manzarasini aks ettiradi. Bu jarayon Vestern-blotting yoki elektroblotting deb ataladi. Blottingdan keyingi standart antigen va molekulyar og‘irlik markerlarining treklarini oqsilli yoki uglevodli bo‘yoqchi bilan bo‘yaladi, qolganlarini antitelalar namunalari bilan inkubatsiya qilinadi. Nishonlangan antitelalar yordamida ayrim antigenli bo‘lakchalar aniqlanadi. Bu bosqichni immun kimyoviy bo‘sh bosqichi deb ataladi. Usul to‘la xajmda elektroforezning PAAG da molekulalarni bo‘lib tashlash kabi ajoyib xususiyati sifatida ishlatiladi, molekulalar konsentratsiyai kichik bo‘lib, bunda antitelalarning spetsifik antigen komponentlarini aniqlash xossalari xam bor.

SHunday qilib, usuldan ko‘proq antigenlar tarkibi va molekulyar o‘lchamlarini aniqlash uchun foydalaniladi. Bundan tashqari bu usul spetsifik antitelalar (xususan MKA) spetsifikligini aniqlash va bir xil yoki turlicha tuzilgan antigenli preparatlarda (masalan, bakteriyalarning turli xillari, virusli mutantlar, xujayra ekstraktlari va b.) antigeni jixatidan o‘xshash molekulalarni qidirishda juda samarali xisoblanadi.

Tayanch so‘zlar va iboralar:

Vestern-blotting yoki elektroblotting - bunda molekulalar ana shu membrana bilan birikib, elektrofonetik bo‘linish manzarasini aks ettiradigan jarayon.

Nazorat uchun savollar:

1. Immunobiotexnologiya fani nima?

2. Immunologiyaning dolzarb muammolari qaysi soxada ishlatiladi?


Amaliy mashg‘ulot №9 IMMUNFERMENT ANALIZDA ISHLATILADIGAN FERMENT-NISHONLARNI AKTIVLIKLARINI ANIQLASH USULLARI.

Ishni maqsadi: Peroksidaza va ishqoriy fosfataza katalitik aktivligini aniqlash va kon’yugat olish usuli.

Ishni bajarish uchun namuna

6 mg o-fenilendiamin 15ml 0,02 m fosfat-sitrat buferida, rN 5 eritiladi va bu eritmaga 10mkl konsentrlangan (30% li) perekis vodorod qo‘shiladi. So‘ngra ferment eritmsi qo‘shiladi va eritmaning optik zichligini o‘zgarishini 435 nm ( yoki teng hajm 0,1 m H₂SO₄ eritmasi qo‘shilgandan so‘ng 490 nm )da o‘lchanadi.

b) Peroksidaza aktivligini 5- aminosalitsil kislota eritiladi.

Eritma xona haroratigacha sovutiladi. Eritma rN i 6,0 gacha 1 m NaOH bilan etkaziladi va 1 ml N₂O₂. (konsentrlangan 30%-li (9,8m) N₂O₂ eritmasi 100000 marta suyutiriladi).

v)Peroksidaza aktivligini 2,2- azino-di-{3-etil-2,3-di- gidrobenzotiazolin-6-sulfon kislotasining diammoniy tuzi (ABTS) yordamida aniqlash.

g) Peroksidaza aktivligini p-oksifenilpropion kislotasi yordamida fluorimetrik usulda aniqlash.

0,25 g tozalangandan p-oksifenilpropion kislotasi 50ml 0,1 m fosfat buferida rN 8,0 (eritma rN 7,0 gacha kamayadi).

d) Xemilyuminessent usulida peroksidaza aktivligini aniqlash.

1. Peroksidazaning antigen yoki antitela bilan kon’yugati tutgan polistirol probirkalarga D-lyusiferining 0,01 m tris-NS1 rN 8,0 buferdagi 3,6 mM eritmasidan 10mkl va 1,25 mM lyuminol va 2,7 mM perekis vodorod eritmalarining aralashmalaridan 1 ml qo‘shiladi.

2. Ferment kon’gati tutgan polistirol probirkaga lyuminol (1,8 mg lyuminol 10 ml 0,1 N NaOH da eritiladi) ning 1mM li eritmasidan 20 mkl va NaOH ning 0,21M eritmasidan 960 mkl qo‘shiladi.

a) Fotometrik usulda glyukozooksidaza fermenti aktivligini o-fenilendiamin yordamida aniqlash.

100 mg D-glyukoza 10ml 0,01 m fosfat bufer, rN 5,5 da eritiladi. Eritmaga 1 soatdan keyin 1 mg xren peroksidazasi va 2,5 ml (1 mg/ml) o-fenilendiamin qo‘shiladi.

b) Fluorimetrik usulda glyukozooksidaza aktivligini p-oksifeniluksus kislota yordamida aniqlash.

50 mg o-oksifeniluksus kislota 50 ml 0,05 m atsetat buferida, rN 5,0 eritiladi, eritma rN i 5,0 ga 10 m NaOH eritmasi bilan etkaziladi va 1 mg peroksidaza qo‘shiladi. SHu eritmaning 0,25 ml ga 0,01 M fosfat buferida, rN 7,0 0,1 NaC1 va 1 g/l qoramol zardobi al’bumini eritmasida eritilgan glyukozooksidazaning 10mkg eritmasi qo‘shiladi.

Ishqoriy fosfataza

2. 
   Fotometrik usulda ishqoriy fosfataza fermenti aktivligini 4-nitrofenilfosfat yordamida aniqlash.
   

b) Fluorimetrik usulda ferment aktivligini 4-metilumbelliferilfosfat yordamida aniqlash.

2,6 mg 4-metilumbelliferilfosfatni 33,3 ml 0,1 m glitsin-NaOH buferida, rN 10,3 eritib, substratning 0,3 m eritmasi tayyorlanadi. Devorlariga spetsifik sorbsiyalangan fermentning 0,1 ml tarkidida 1mM MgC1₂ , 0,1 mM ZnC1₂ , 0,5 g/l NaN3 va 250 g/l albumin tutgan 0,1 M glitsin-NaOH buferi rN 10,3 qo‘yiladi.

FERMENT – OQSIL KONYUGATLARINI OLINISHI.

a) Nakane usulida xren peroksidazasini immuneoglobulin G bilan konyugati sintezi.

4 mg xren peroksidazasi ( RZ – 3,0) ning 1 ml suvdagi eritmasi 0,2 ml yangi tayyorlangan 0,1 M NaJO₄eritmasi qo‘shiladi va xona haroratida 20 minut mobaynida aralashtiriladi. Olingan eritma tun bo‘yi 4⁰S da 0,001 M natriy atsetat buferi, rN 4,4 ga qarshi dializ qilinadi yoki sefadeks G-25 li kolonka (1 x 10sm) da xromatografiya qilinadi. SHu modifikatsiya qilingan peroksidazaga 20 mkl 0,2 M natriy karbonat buferi rN 9,5 va 8 mg immunoglobulin G ning 2 ml yuqoridagi buferdagi eritmasi qo‘shiladi. Reaksion aralashma 2 soat mobaynida xona haroratida aralashtiriladi, 0,1 ml yangi tayyorlangan NaBH₄(4mg/ml) ning suvli eritmasi qo‘shildi va 4⁰S da 2 soat mobaynida aralashtiriladi. Olingan kon’yugat (NH₄) ₂SO₄ tuzi bilan cho‘ktiriladi va dializ qilinadi yoki sefadeks G-200 tutgan kolonka ( 1,6 x 35 sm)da xromatogrfiya qilinadi. Birinchi pik yig‘iladi. Kon’yugatni stabillash uchun BSA (1%) , mertiolat (0,025%) yoki glitsirin (50%) qo‘shiladi va oz-oz miqdorda 4⁰S da saqlanadi.

b) Glutar dial’degidi yordamida i munoglobulin G ning xren peroksidazadasi ( RZ= A₄₀₃/A₂₇₅- 0,3) 0,2 ml tarkibida 0,15 M NaC va 1,25% -li glutar dial’degidi tutgan 0,2 ml 0,1 M fosfat buferida, rN 6,8 eritiladi va xona haroratida tun bo‘yi aralashtiriladi. Glutar dial’degidni ortiqchasini 0,15 M NaC1 eritmasiga qarshi dializ yo‘li bilan yoki sefadeks G-25 tutgan kolonkada (1 x 10 sm ) xromotografiya usulida yo‘qotiladi. 0,15M NaC1 eritmasi bilan 1ml gacha suyultiriladi, 1ml immunoglobulin G ning 0,15 M NaC1 dagi eritmasi v 0,1ml 1 m karbonat buferi, rN 9,5 qo‘shiladi. Xona haroratida 2 soat mobaynida inkubsiya qilinadi va tarkibida 0,15 M NaC1tutgan 0,01 M (NH₄)SO₄ ning to‘yingan eritmasini ekvivalent hajmi bilan cho‘ktiriladi va 1 ml fosfat buferida eritiladi. Eritma fosfat buferiga qarshi dializ qilinadi. Eritma 10000 g da 30 minut sentrfugirlanadi, cho‘kmadan ajratiladi, 1%-gacha al’bumin qo‘shiladi va teshikchalarning diametri 0,2 mkm bo‘lgan filtr orqali filtirlanadi. Olingan konyugat – 20⁰S yoki teng hajm glitserin qo‘shgandan so‘ng +4⁰S haroratda saqlanadi.

Agglyutinatsiya – suyuqlikdagi zarrachalar (bakteriyalar, eritrotsitlar va boshqa xujayra elementlari)ning bir biriga yopishib, g‘ujlanib qolishi.

1. Immunobiotexnologiya fani nima?

2. Immunologiyaning dolzarb muammolari qaysi soxada ishlatiladi?


Amaliy mashg‘ulot №10 : POMIDOR VIRUSLARINI IMMUNOFERMENT ANALIZNING “SENDVICH” USULIDA ANIQLASH.

Ishni maqsadi: POMIDOR VIRUSLARINI IMMUNOFERMENT ANALIZINING “NIQOBLANISH” USULIDA ANIQLASH.

Ishni bajarish uchun namuna

Viruslarni IFA ning “Sendvich” usulida aniqlash polistirolga adsorbsiyalangan qarshi antitelalarning ketma ket virus va antitelalarning peroksidaza bilan konyugati bilan ta’sirlashishini o‘z ichiga oladi. Qattiq fazadagi ferment aktivligi virusning boshlang‘ich konsentratsiyasiga proporsionaldir va tekshirilayotgan namunadagi virus miqdorini xarakterlaydi.

Kerakli material va asboblar: Pomidor virusi va unga qarshi olingan antitela, spetsifik antitelalarning peroksidaza bilan kon’yugati, peroksidaza aktivligini aniqlashga 5-aminosalitsil kislota asosida substrat aralashmasi, polistrol planshetlari, avtomat-pipetkalar, spektrofotometr.

Usulining tavsifi

1.Antitelalaradsorbsiyasi:antitelalarningadsorbsion immunobilizayiyasiga antitelalarning fosfatbuferidagi 5 mkg/ml li konsentratsiyadgi eritmasi ishlatiladi. Planshet chuqurchasiga 0,2 ml eritma quyiladi. So‘ngra planshetlar qopqog‘i bilan berkitiladi va 4⁰S da tun bo‘yi qoldiriladi. Eritmsiga planshet chuqurchalaridagi suyuqlik to‘kib tashlanadi va tvin-20 tutgan fosfat buferi (TFB) bilan yuviladi. Planshetlar havoda kiritilgandan so‘ng – 20⁰S da bir necha oy mobaynida immunologik aktivligini yo‘qotmaydi.

2. Tekshirilayotgan namunalarni qo‘shish: Hamma tekshirilayotgan namunalar planshet chuqurchalariga 0,2 ml hajmdagi TFB /boshlang‘ich virus namunasi 10-50 marta suyultiriladi/ solinadi va 37 S da1 soatga qoldiriladi. Har bir aniqlanayotgan namuna uchun 2-3 parallel o‘lchash o‘tkaziladi. Kontrol sifatida virus bilan zararlangan sog‘ o‘simlik ekstraktlari olinadi.

3. So‘ngra antigen eritmasi to‘kib tashlanadi va 4 marta TFB bilan yuviladi. Konyugat TFB da 1 – 2,5 mkg/ml konsentratsiyagacha suyultiriladi va planshet chuqurchalariga 0,2 dan qo‘yiladi. Planshetlar 37⁰ S da 1 soat davomida qoldiriladi va 4 marta TFB bilan yuviladi.

4. keyin planshet chuqurchalariga 0,2 ml substrat aralashmasi qo‘shiladi va xona haroratida 30-40 minutga qoldiriladi. IFA natijalari ko‘z bilan yoki spektrofotometrda λ= 450 nm da o‘lchanadi.

POMIDOR VIRUSLARINI IMMUNOFERMENT ANALIZINING “NIQOBLANISH” USULIDA ANIQLASH.

VTM ning pomidor shtammi bilan kasallangan pomidor barglaridan virus ajratiladi. Bu virus polimid granulalariga bifunksional agentlar ( glutar dialdegidi, gossipol ) yordamida 0,1M borat buferida rN 8,5 (5⁰Sda 24 soat) immobilizatsiyalanadi. Sorbentdagi erkin aldegid gruppalari monoetanolamin bilan blokirovka qilinadi. Olingan sorbent virusga qarshi antitelalarni tozalashda ishlatiladi. VTM ning pomidor shtamiga qarshi antitelalar quyonlarni immunizatsiya qilib olinadi. Antitelalar titri 1%-li agar gelida Uxterloni usulida aniqlanadi. VTM ga qarshi zardob 0,05 M tris-NS↑ rN 7,0 buferida ( tarkibida 30 mM kalsiy xlorid, etilenglikol tutgan) 5⁰S da 2 soat mobaynida doimiy ravishda chayqatib dsorbsiyalanadi va sorbent bufer bilan yuvib tashlanadi. Antitelar desorbsiyasi tarkibida 1 M KS1 tutgan 0,05 M tris-NaOH buferi, rN 11,0 yordamida amalga oshiriladi. VTM-TSH va fosfolipaza A2 konyugatlari ikki olinadi. Birinchi usulda 0,05 M borat buferi rN 9,0 dagi 0,2 ml ferment eritmasiga ( 2 mg/ml) 0,1 ml VTM suspenziyasi (3mg/ml) qo‘shiladi. Keyin aralashmaga chayqatib tutgan holda tomchilatib 0,1 ml 2,5%-li glutar dialdegidi eritmasi va 0,6 ml 0,1 M borat buferi, rN 9,0 qo‘shiladi. Aralashma 4⁰S da 15-20 soat mobaynida inkubatsiya qilinadi va 2 sutka davomida dializ qilinadi. Kon’yugat eritmasi sentrifugirlangadan ferment so‘ng ferment aktivligi aniqlanadi.

Ikkinchi usul shu usulda olingan kon’yugatni poliamid-kefalin va poliamid-VTM sorbentlar biospetsifik xromatografiya usulida tozalashdan iborat.

Immunoferment diagnostikum quyidagilarni o‘z ichiga oladi:

4. 
   TSH-VTM ning tozalangan preparati ( kalibrovka egri chizig‘ini tuzish uchun) ;
   
5. 
   virus va fosfolipaza A2 konyugati;
   
6. 
   3,1 mM tuxum letsitini, 10 mM CaC1₂, 8 mM triton X-100, 0,5 m tris-NS1, rN 8,5 tutgan substrat aralashmasi.
   

Agglyutinatsiya – suyuqlikdagi zarrachalar (bakteriyalar, eritrotsitlar va boshqa xujayra elementlari)ning bir biriga yopishib, g‘ujlanib qolishi.

1. Immunobiotexnologiya fani nima?

2. Immunologiyaning dolzarb muammolari qaysi soxada ishlatiladi?

ESSE usuli

Bu usul ham inson fikrlash qobiliyatini rivojlantirishda muhim ahamiyatga ega. Ular norasmiy fikr va qiyofalarni qayd qilish har tomonlama

ko‘rib chiqilmaguncha xotirada saqlab turish va ularni yanada aniqroq

ifodalashga imkon beradi. Biotexnologiya yo‘nalishlari xaqida esse usulida taxlil qilish.

V.KEYSLAR BANKI

10. 
    Keys bilan tanishuv (individual)
    
11. 
    Asosiy muammoni (oquv muammosini) ajratib olish va organish (individual va kichik guruhlarda)
    
12. 
    Goyalar yigish va muammoning echimini izlash (kichik guruxlarda)
    
13. 
    Keys echimi uchun taklif etilgan goyalarni taqdimoti, tahlil va baholash (oqituvchi va kichik guruhlar)
    

• 
  Limfoid organdan immunostimulyator (timektomin) kam miqdorda ajratib olinmoqda.Buning sabablari aniqlanib,bartaraf etilishi zarur.
  

1Immunostimulyator olish texnologiyasining bosqichlarini o‘rganish;

2.Texnologik jarayon davomida yuzaga keladigan muammolarni bartaraf etishni o‘rganish;

O‘quv faoliyatidan kutiladigan natijalar:

- Timusdan olingan faol modda asosida immunostimulyator vositalarini ishlab chiqarishni yo‘lga qo‘yish;

- Biofaol moddalar aralashmasidan preparatni ajratib olish bilan bog‘liq muammoli vazifalarni echishda nazariy bilimlarga ega bo‘ladi;

- Muammoni aniqlab, uni hal qilishda echim topishni uddalay oladi.

• 
  Timektomin stimulyatorining o‘ziga xos xususiyatlarini;
  
• 
  Ishlab chiqarish texnologiyasining bosqichlarini.
  

• 
  Mavzuni mustaqil o‘rganadi;
  
• 
  Muammoni mohiyatini aniqlashtiradi, g‘oyalarni ilgari suradi;
  
• 
  Ma’lumotlarni tanqidiy nuqtai nazardan ko‘rib chiqib, mustaqil qaror qabul qilishni o‘rganadi;
  
• 
  O‘z nuqtai nazariga ega bo‘lib, mantiqiy xulosa chiqaradi;
  
• 
  O‘quv ma’lumotlari bilan mustaqil ishlaydi, ma’lumotlarni taqqoslaydi, tahlil qiladi va umumlashtiradi.
  

• 
  Kommunikativ ko‘nikmalarga;
  
• 
  Taqdimot ko‘nikmalariga;
  
• 
  Hamkorlikda ishlash ko‘nikmalariga;
  
• 
  Muammoli holatlarni tahlil qilish ko‘nikmalariga.