Amiloid -peptid által indukált komplement aktiváció gátlása kis molekulatömegű szintetikus vegyületekkel in vitro

DOKTORI ÉRTEKEZÉS TÉZISEI

Készítette: Dr. Sárvári Miklós

Richter Gedeon Vegyészeti Gyár Nyrt

Farmakológiai és Gyógyszerbiztonsági

Kutatási Főosztály

Témavezető: Dr. Sass Miklós egyetemi tanár

Eötvös Lóránd Tudományegyetem

Természettudományi Kar

Anatómiai, Sejt- és Fejlődésbiológiai Tanszék

BIOLÓGIAI DOKTORI ISKOLA

Vezető: Dr. Erdei Anna, akadémikus
MOLEKULÁRIS SEJT- ÉS NEUROBIOLÓGIAI DOKTORI PROGRAM

Vezető: Dr. Sass Miklós, tanszékvezető egyetemi tanár

2007.
BEVEZETÉS
Az utóbbi évek preklinikai és klinikai kutatási eredményei szerint az agy neuroimmunológiai folyamatai fontos szerepet játszanak a neurodegeneratív betegségek kialakulásában. Ezekben a folyamatokban a komplementrendszer, az asztroglia és mikroglia sejtek központi szerepet játszanak. A krónikus komplement aktiváció jelenléte az agyban az időskori demenciák egyik közös jellemzője. Több, az egyes betegségekre jellemző, fehérje természetű komplement aktivátort azonosítottak. A komplement első komponensének q alegysége (C1q) köt az amiloid -peptidhez, amely oki kapcsolatba hozható az Alzheimer kór kialakulásával. A kölcsönhatás a komplement klasszikus útjának aktivációját eredményezi. Az aktiváció során felszabaduló komplement fragmentumok a plakkképződés helyére toborozzák a mikroglia és asztroglia sejteket. A glia sejtek gyulladásserkentő molekulákat, köztük komplement fehérjé-ket termelnek, amelyek az aggregátum eltávolítását célozzák. A mikroglia sejtek azonban nem tudják bekebelezni a képződött amiloid plakkokat, amelyek így állandó komplement aktivációs forrásokká válnak.

A komplement aktiváció toxikus hatásai ellen szolubilis és membránkötött fehérjék védik a szervezet saját sejtjeit. A krónikus komplement aktiváció az agyban azért különösen veszé-lyes, mert egyes agyterületeken a komplement regulátor fehérjék alacsony szintje védtelenné teszi az idegsejteket a membránkárosító komplex kialakulásával szemben. Kutatásaim az aktiváció útvonalának felderítésére, és szelektív komplement gátlók kifejlesztésére irányultak.

1. 
   Ismert, hogy az amiloid -peptid aktiválja a komplement rendszert in vitro. Az aktiváció funkcionális hatásainak vizsgálatára egy in vitro sejtalapú rendszer kidolgozását tűztük ki.
   
2. 
   Az amiloid -peptid által kiváltott komplement aktivációhoz irodalmi adatok alapján mind a klasszikus, mind az alternatív út hozzájárul. Nem jelent meg azonban összefoglaló vizsgálat arról, hogy melyik útvonal játssza a főszerepet az aktiváció során. Ezt a kérdést egy endogén komplement szabályozó fehérje, a C1 inhibítor (C1-Inh) hatásának vizsgálatával kívántuk tanulmányozni.
   
3. 
   A központi idegrendszerben található komplement komponensek nagyrészét az agy szöveti makrofágja, a mikroglia termeli. Különböző komplement gének kifejeződését vizsgáltuk kezeletlen és lipopoliszacharid kezelt mikroglia sejtekben in vitro.
   
4. 
   Mára egyetértés alakult ki abban, hogy az amiloid -peptid oki szerepet játszik az Alzheimer kór kialakulásában. Vizsgálni kívántuk, hogy a peptid befolyásolja-e korai komplement gének átíródását mikroglia sejtekben in vitro.
   
5. 
   Az aktivációért felelős útvonal és a mikrogliális expresszió ismeretében egy farmakológiai beavatkozásra alkalmas támadáspont kiválasztása, amelynek révén szelektíven gátolható legyen a komplement aktiváció.
   
6. 
   A szakirodalomban kevés komplement inhibítort írtak le, klinikán pedig nincs szelektív, kis molekulatömegű komplementgátló. Ezért célul tűztük ki ismert vegyületek tanulmányozását a kiválasztott célfehérje (target) funkciójára.
   
7. 
   A Társaság tulajdonában levő vegyülettár mérete és szerkezeti diverzitása révén alkalmas lehet új kémiai szerkezetek azonosítására. Egy nagy áteresztőképességű módszer beállítása és validálása után szűrjük a vegyülettárat. Optimalizálás után vezérmolekulát választunk ki.
   
8. 
   A kiválasztott vegyületet hatékonysági és szelektivitási vizsgálatokkal jellemezzük.
   
9. 
   A vezérmolekula egy molekula részlethez kötődve fejti ki a hatását. Tanulmányozni kívánjuk, hogy a vegyület melyik fehérje molekulához köt.
   
10. 
    A vezérmolekula szelektíven gátolja a komplement aktiváció valamelyik lépését. In vitro sejtalapú tesztben vizsgálni kívánjuk, hogy a molekula felfüggeszti-e a komple-ment toxikus hatását az idegsejtekre.
    

Primer egér mikroglia tenyészeteket újszülött NMRI egerek agyából készítettünk egy általánosan használt módszert követve. CD18 festés alapján a sejtek több, mint 95%-át találtuk mikrogliának. Primer patkány hippokampális sejttenyészeteket újszülött Wistar patkányok agyából készítettünk egy korábban kidolgozott eljárás alapján.

A sejtekből totál RNS-t izoláltunk a Stratagene RNS izoláló kitjével a gyártó által javasolt recept alapján. A minták integritását agaróz gélben vizsgáltuk etidium-bromid festést követően. Az RNS koncentrációkat 260nm-en mért abszorpcióval határoztuk meg. Azonos mennyiségű RNS mintákat fordítottunk át cDNS-sé RNáz inhibítor jelenlétében MuLV reverz transzkriptáz (Stratagene) enzimmel.

A polimeráz láncreakciót 50l térfogatban, 1 egység Tag DNS polimeráz (Stratagene) jelenlétében végeztük Hybaid Thermocycler készülékben. A reakciót általánosan használt paraméterekkel (94^oC 30 másodperc, 60^oC 30 másodperc, 72^oC 1 perc), 25 ciklussal futtatva egy 10 perces extenziós idő után fejeztük be.

A mikrotiter lemezek borítását és a C1q kötést egy közölt leírás módosítása alapján végeztük. A C1q kötést szobahőmérsékleten végeztük 60 percig a jelzett koncentrációban, majd a kötött C1q mennyiségét standard ELISA módszerrel határoztuk meg. A C1q-t anti-humán C1q anti-testtel reagáltattuk, majd biotin-jelzett második antitestet, és Extravidin-HRPO-t használtunk. Az enzim mennyiségét TMB szubsztrát hasítása alapján határoztuk meg. A mérést Tecan Spectra fotométeren végeztük 450 nm-en. Az antitest-C1q kötési vizsgálatban a lemezt 10 mg/ml ovalbuminnal borítottuk 4 ^oC-on. Az antigén fölösleg eltávolítása után immunkomp-lexet képeztünk anti-ovalbumin 1:400 hígítású oldatával. A C1q kötést és a mennyiségi meghatározást a fent leírtak szerint végeztük.

A komplement-függő A toxicitás mérést egy közölt módszert módosítva végeztük. Egy hét-tel lemezelés után a hippokampális sejtek morfológiáját ellenőriztük. Komplement aktivátor-ként A1-40 peptidet, kontrollként a fordított A40-1 peptidet használtuk. A peptideket használat előtt DMSO-ban oldottuk, majd tápfolyadékban hígítottuk a kívánt koncentrációra. Friss, normál humán szérumot használtunk komplement forrásként. 25l A törzsoldat és 15l normál humán szérum került minden kamrába, ami 40M A és 3% szérum koncentrá-ciót eredményezett. A toxicitást a tápfolyadékban mérhető LDH aktivitás alapján határoztuk meg Cytotoxicity Detection kittel (Roche Diagnostics).

A tömeg spektrumokat Finnigan MAT 95SQ tandem spektrométeren elektrospray ionizációs forrást használva vettük fel (Skribanek és mtsai, 2001). A vizsgálatban N2 védő-gázt használtunk, 3kV spray feszültség és 70V feszültség mellett. Az anyagok oldására 2mM CH₃CO₂NH₄ – 0,5% ecetsav (v/v) 1:1 elegyét használtuk. 20 l mintát injektáltunk az eluens áramba, áramlási sebesség 50 l.

Kutatásaim a komplement központi idegrendszerben bekövetkező aktivációjának és következ-ményeinek felderítésére irányultak.

1. 
   Ismert, hogy az amiloid -peptid (A) aktiválja a komplement rendszert in vitro. Az aktiváció funkcionális hatásainak vizsgálatára egy in vitro sejtalapú rendszer kidolgo-zását tűztük ki. Megállapítottuk, hogy hippokampális sejtek érzékenyek az A által kiváltott komplement aktiváció litikus hatásaira. Ezt a megfigyelést felhasználva és egy közölt módszer alapján kidolgoztunk egy sejtalapú tesztet, ami alkalmasnak bizo-nyult arra, hogy az A által indukált komplement aktiváció citotoxikus hatásait kimutassuk in vitro (Sárvári és mtsai, 2003).
   
2. 
   Az A által kiváltott komplement aktivációhoz irodalmi adatok alapján mind a klasz-szikus, mind az alternatív út hozzájárul. Nem jelent meg azonban összehasonlító vizs-gálat arról, hogy melyik útvonal játssza a főszerepet az aktiváció során. Ezt a kérdést a C1r és C1s proteázokat gátló C1-Inh hatásának vizsgálatával tanulmányoztuk. Megállapítottuk, hogy a klasszikus aktivációs út endogén szabályozó molekulája, a C1-Inh védelmet biztosított hippokampális sejtek számára az A-indukálta komple-ment citotoxikus hatásaival szemben in vitro (Sárvári és mtsai, 2003). Eszerint az aktiváció döntően a klasszikus útvonalon keresztül történik.
   
3. 
   A központi idegrendszerben több sejttípusról is kimutatták, hogy komplement fehérjé-ket termelnek. A komplement komponensek jelentős részét az agy szöveti makrofágja, a mikroglia termeli. Irodalmi adatokkal összhangban kimutattuk, hogy mikroglia sejtekben konstitutívan kifejeződnek a komplement első komponensének láncait kódoló gének in vitro. Megállapítottuk, hogy a mikroglia felszínén több komplement receptor, C1qR, CR3 és C5aR található. Ezek az eredmények arra utaltak, hogy a mikroglia komplement receptorai révén érzékeli az aktiváció során felszabaduló aktivációs fragmentumokat, és a sejtek az aktivációt kiváltó anyag köré sereglenek. Ebből következik, hogy a komplement aktiváció és a mikroglia sejtek központi szerepet játszanak a központi idegrendszer gyulladásos folyamataiban.
   
4. 
   Mára egyetértés alakult ki abban, hogy az A oki szerepet játszik az Alzheimer kór kialakulásában. Tanulmányoztuk, hogy a peptid befolyásolja-e a C1q és a C1-Inh génjeinek átíródását mikroglia sejtekben in vitro. Megállapítottuk, hogy az A koncentráció-függő módon növeli a C1q génjeinek átíródását, míg csökkenti a C1-Inh transzkripcióját (Sárvári és Pázmány, nem közölt eredmény). Ez az eredmény megerősítette azt az elképzelésünket, hogy az amiloid felszabadulás és lerakódás környezetében aktiválódik a komplementrendszer, ám az aktiváció és szabályozó mechanizmusok egyensúlya felborul és az aktiváció krónikussá válik.
   
5. 
   Az aktivációért felelős útvonal és a mikrogliális expresszió ismeretében a komplement első komponensének q alegységét farmakológiai beavatkozásra alkalmas célpontnak választottuk (Sárvári és Pázmány, nem közölt eredmény). Irodalmi és saját eredmé-nyeink alapján valószínűsítettük, hogy a C1q A kötőhelyének gátlása révén a komplement aktiváció szelektíven gátolható.
   
6. 
   A szakirodalomban kevés komplement inhibítort írtak le, klinikán pedig nincs szelek-tív, kis molekulatömegű komplementgátló. Ezért először egy glikózaminoglikán, majd egy kereskedelmi úton beszerezhető gyűjtemény vegyületeinek hatását tanulmányoz-tuk a kiválasztott célfehérje, a C1q funkciójára. Megállapítottuk, hogy a kiválasztott glikózaminoglikán és a gyűjtemény néhány (7) vegyülete gátolta a C1q kötést A peptidhez (Urbányi és mtsai, 2005).
   
7. 
   A Társaság tulajdonában levő vegyülettár mérete és szerkezeti diverzitása révén alkalmas új kémiai szerkezetek azonosítására. Egy nagy áteresztőképességű módszer beállítása és validálása után szűrtük a vegyülettárat. Kémiai optimalizálás után vezér-molekulát választunk ki (Sárvári és mtsai, 2003).
   
8. 
   A kiválasztott vezérmolekulát hatékonysági és szelektivitási vizsgálatokkal jellemez-tük. Megállapítottuk, hogy a vegyület gátolta a C1q kötést A peptidhez és más nem-immunglobulin aktivátorokhoz, de nem gátolta a kötést immunglobulinokhoz (Sárvári és mtsai, 2003). Ezek az eredmények bizonyították, hogy a C1q A kötőhelye szelektíven gátolható.
   
9. 
   ESI-MS vizsgálatokkal kizártuk, hogy a vezérmolekula köt az A peptidhez. A kísérlet eredménye megerősítette, hogy a vegyület a C1q A kötőhelyén keresztül fejti ki hatását (Sárvári és mtsai, 2003).
   
10. 
    A vezérmolekula szelektíven gátolta a komplement aktiváció első lépését. In vitro sejtalapú tesztben vizsgáltuk, hogy a molekula felfüggeszti-e a komplement toxikus hatását az idegsejtekre. Megállapítottuk, hogy a vezérmolekula az aktiváció első lépését gátolva megvédte a hippokampális sejteket az A-indukálta komplement aktiváció citotoxikus hatásaival szemben (Sárvári és mtsai, 2003).
    

1. 
   In vitro vizsgálatok arra utaltak, hogy a komplementrendszer klasszikus és alternatív útja is aktiválódik amiloid -peptid (A) hatására. A klasszikus útvonal aktivációjában a C1 szerepe kulcsfontosságú, amit bizonyít, hogy az A aktiválja a tisztított C1q, C1r és C1s alegységekből képzett C1 komplexet. Igazoltuk, hogy a C1r és C1s proteázok endogén szabályozója, a C1-Inh, megvédte a hippokampális sejteket a komplement-függő A toxicitás ellen in vitro. Ez az eredmény bizonyította, hogy az A döntően C1q-n keresztül aktiválja a komplementrendszert (Sárvári és mtsai, 2003).
   
2. 
   Ennek a megfigyelésnek az alapján választottuk farmakológiai beavatkozás molekulá-ris célpontjának a C1q molekulát. Először olyan ismert vegyületeket azonosítottunk, amelyek gátolták a C1q kötést A peptidhez. Ilyen molekulák voltak egy állati eredetű glikózaminoglikán (Urbányi és mtsai, 2005) és az RBI vegyület gyűjtemény hét farmakológiailag aktív vegyülete, köztük a tamoxifen. Ezek a vegyületek nem befo-lyásolták a C1q kötést immunglobulinok Fc régiójához. Az eredmény azt mutatta, hogy a C1q molekulán található A kötőhely szelektíven gátolható kis molekula-tömegű szintetikus vegyületekkel..
   
3. 
   A Társaság vegyülettárából 308 olyan vegyületet azonosítottunk, amelyek gátolták a C1q kötést A peptidhez (Sárvári, Kósa, Pázmány, nem közölt eredmény). A 308 vegyület közül 301 nem befolyásolta a C1q kötést immunkomplexben lévő antitestek Fc régiójához. A 308 vegyület közül 56 gátolta a C1q kötést C-reaktív proteinhez és 35 mielin bázikus fehérjéhez (Sárvári és Pázmány, nem közölt eredmény). Az eredmény megerősítette, hogy a C1q molekulán található A kötőhely szelektíven gátolható.
   
4. 
   Kémiai optimalizálással vezérmolekulát állítottunk elő. A vegyület mikromoláris koncentráció alatt gátolta a C1q kötést A peptidhez, C-reaktív proteinhez (CRP) és mielin bázikus fehérjéhez (Sárvári és mtsai, 2003). Tehát a vezérmolekula gátolta a C1q kötést több nem-immunglobulin C1q aktivátorhoz is.
   
5. 
   Az irodalomban ellentmondó adatok találhatóak a nem-immunglobulin C1q aktivátorok kötőhelyeire vonatkozóan. Ezért összehasonlítottuk a vezérmolekula és a más laboratóriumok által vizsgált A14-26 peptid gátlási állandóit (IC₅₀). A két IC₅₀ egyezősége arra utalt, hogy a CRP kötőhelye a C1q molekulán az A lánc 14-26 szakaszán található. A két IC₅₀ érték A esetén két nagyságrend eltérést mutatott. Ez alapján valószínű, hogy az A kötőhely a C1q molekulán nem az A14-26 régióban található.
   
6. 
   A vezérmolekula szelektivitását vizsgálva megállapítottuk, hogy az nem gátolta a C1q kötést immunglobulin G molekulákhoz, és nem gátolta a szérum amiloid P kötést A peptidhez (Sárvári és mtsai, 2003).
   
7. 
   ESI-MS kísérletekkel igazoltuk, hogy a vezérmolekula nem kötődött A peptidhez. Ezért a vegyület valószínűleg a C1q A kötőhelyére köt (Sárvári és mtsai, 2003).
   
8. 
   A vezérmolekula a beállított sejtalapú vizsgálatban C1q-n keresztül gátolta a komple-mentrendszer aktivációját és megvédte a hippokampális sejteket a komplement-függő A toxicitás ellen in vitro (Sárvári és mtsai, 2003).
   

Functional effects of domain deletions in a multidomain serine protease, C1r

neurodegenerative effects of serum amyloid P component in vitro