10. ábra Mikroglia sejtekben folyó C1q szintézis immunhisztokémiai vizsgálata. Egér mikroglia sejteket növesztettünk 6 lyukú műanyag lemezen, majd 4% PFA fixálás után humán C1q ellen termelt nyúl antitesttel próbáltuk egy éjszakán át 4oC-on. Második antitestként fluoreszcensen jelzett anti-nyúl IgG-t használtunk.
6.3.3 A peptid hatása C1q és C1-Inh gének átíródására
Eredményeink arra utaltak, hogy a C1q állandóan termelődik mikroglia sejtekben. Mivel a mikroglia sejtek felszínén jelen van a C1qR, ezért a C1q fehérje kötését pusztuló sejtekhez, sejttörmelékhez vagy fehérje aggregátumokhoz a mikroglia sejtek képesek érzékelni. Az a tény, hogy mind a C1q ligand, mind receptora folyamatosan termelődik mikroglia sejtekben, arra utal, hogy a komplement klasszikus útja kiemelt szerepet játszhat az agyszövetben történő komplement aktivációban. Ezért a következőkben a C1q és a klasszikus út szabályozó molekulájának, a C1-Inh génjének transzkripcióját vizsgáltuk kezeletlen és A peptiddel kezelt mikroglia sejtekben. Az interferon (IFN a komplement gének transzkrip-ciójának egyik fontos szabályozója, ezért az IFN kezelést pozitív kontrollként használtuk.
A B
11. ábra C1q B lánc (A) és C1-Inh (B) gén transzkripciója mikroglia sejtekben. Kezeletlen mikroglia (1), IFN (2), A (3), IFN és A (4) kezelt mikroglia. A keletkező frag-mentumok mérete: C1q 231 bp, C1-Inh 315 bp. A belső kontrollként használt aktint (500 bp) nyíllal jelöltük.
A kísérlet eredménye azt mutatta, hogy a C1-Inh transzkript mennyisége a kimutathatóság határán volt. A gén átíródása IFN hatására emelkedett, A peptid hatására nem volt kimutat-ható változás. Tehát mikroglia sejtekben a C1q gén átíródásához képest alacsonyabb szintű C1-Inh átíródás történt (Sárvári és Pázmány, nem közölt eredmény).
A következőkben A peptid hatását vizsgáltuk a mikroglia sejtekben folyó C1q transzkrip-cióra. A peptid hatásának koncentráció függését tanulmányoztuk kezelés után 4 órával.
12. ábra A kezelésére bekövetkező C1q transzkripcióváltozás mikroglia sejtekben 4 órával kezelés után. A koncentráció-függő hatásának tanulmányozása: 0 (1), 1M (2), 2M (3), 5M (4) 10M (5) A1-42 peptid. IFN kontroll (6). A kezelés alatt a sejtek életképes-ségét LDH méréssel ellenőriztük, és a médiumban található LDH nem változott. Az aktinra normált C1q értékek sorrendben: (1) 0,07 ; (2) 0,08 ; (3) 0,08 ; (4) 0,13 ; (5) 0,19 ; (6) 0,41. A gél alatt látható diagrammon a fenti értékeket ábrázoltuk.
A kísérlet eredménye azt mutatta, hogy az A kezelés után 4 órával a C1q átíródása a peptid koncentrációjával arányosan emelkedett. Jelentős hatás csak magas A koncentrációnál jelentkezett, itt a C1q átíródása több mint kétszeresére emelkedett (Sárvári és Pázmány, nem közölt eredmény).
Asztroglia sejtekben kimutatható a C1-Inh gén transzkript, amelynek változását követtük IFN és A peptid kezelést követően. IFN hatására emelkedett, A peptid hatására csökkent a C1-Inh gén átíródása.
13. ábra C1-Inh gén átíródása asztroglia sejtekben kezelés után 24 órával. Kezeletlen kontroll (1-2), IFN (3-4) és A (5-6) kezelt asztroglia sejtek. A keletkező 315 bp C1-Inh és a belső kontroll aktin fragmentumokat nyíllal jelöltük. A szemmel is érzékelhető változásokat kiértékeltük UVP Grab It software segítségével. Az aktinra normált C1-Inh mennyiségek sorrendben: (1) 0,58 ; (2) 0,51 ; (3) 0,73 ; (4) 0,75 ; (5) 0,37 ; (6) 0,36 .
A kísérletek eredményei azt mutatták, hogy A peptid hatására a C1q és a C1-Inh gén átíródása ellentétes módon változott. A C1-Inh transzkripciójának csökkenése (és a C1q emelkedése) maga után vonhatja az aktiváció-inhibíció egyensúlyának eltolódását, és A jelenlétében szabályozatlanná válhat a klasszikus reakcióúton zajló aktiváció.
6.4 A C1q és A közötti kölcsönhatás tanulmányozása
6.4.1 Humán és egér C1q kötése A1-42 peptidhez
A C1q molekulán az A kötőhely kialakításában az A láncban egy N-terminális közeli régió játszik döntő szerepet. Az emberi és az egér C1q A lánca nagyon hasonlít egymáshoz, de ebben az A14-26 régióban különbözik. A két fajból izolált C1q kötését vizsgáltuk A peptidhez.
14. ábra Humán és egér C1q kötése A peptidhez. Szilárd-fázisú kötési vizsgálat, humán C1q (kék), egér C1q (lila). A pontok három független mérés átlagai. A kötés erősségét jellemző EC50 érték humán és egér C1q esetében 50 ng/ml, illetve 105 ng/ml.
A humán és egér C1q különböző erősséggel kötődik A peptidhez (Webster és mtsai, 1999). Ezt valószínűleg a kötésben résztvevő A lánc humán 14-26 szekvenciában található 16R és 20R hiánya okozza az egér C1q A láncában. A kötés erősségének különbségét az általunk beállított vizsgálattal ki tudtuk mutatni (Sárvári és Pázmány, nem közölt eredmény).
6.4.2 Az ionerősség hatása
A kölcsönhatásban valószínűleg savas illetve bázikus oldalláncok vesznek részt. Ezért a következőkben az ionerősség hatását tanulmányoztuk.
15. ábra A C1q és A kötés az ionerősség függvényében: 0 (folyamatos vonal, kék négyszög), 10mM (folyamatos vonal, fehér négyszög), 50mM (szaggatott vonal, kék háromszög) és 100mM (szaggatott vonal, fehér háromszög) NaCl. Látható, hogy az abszorbanciával arányos kötött C1q mennyisége a növekvő NaCl koncentrációval csökken. Más szavakkal, a kötés erőssége fordítottan arányos az ionerősséggel, ami arra utal, hogy ionos kölcsönhatások játszanak szerepet a kötésben. Az EC50 értékek a növekvő ionerősség sorrendjében: 50 ng/ml, 35 ng/ml, 110 ng/ml és 460 ng/ml.
A kötés ionerősség függésének kimutatásával validáltuk az általunk beállított C1q-A kötési tesztet. A teszt alkalmas arra, hogy nagyszámú vegyület hatását vizsgáljuk és ezáltal olyan molekulákat azonosítsunk, amelyek gátolják a C1q kötést A peptidhez.
6.5 C1q kötést gátló ismert vegyületek
6.5.1 Glikózaminoglikánok
A heparin és más glikózaminoglikánok kötnek a C1q molekulához, és ezáltal gátolják az immunglobulinoktól eltérő komplement aktivátorok kötését. Egy sertés méhből izolált (Takács és mtsai, 1982) glikózaminoglikán, a GAG1 hatását vizsgáltuk a C1q-A és C1q-SAP kötésre.
|
