Amiloid -peptid által indukált komplement aktiváció gátlása kis molekulatömegű szintetikus vegyületekkel in vitro

A komplement fehérjék legtöbbje egy polipeptid láncból áll. Több komplement komponens, mint például a C3, C4 és C5 egy polipeptid láncban szintetizálódik, és alakul a processzálás során több láncúvá (Campbell és mtsai, 1988). Mindközül legbonyolultabb a C1q bioszintézise, amely 3 géntermék 6-6 kópiájából épül fel. Emiatt a fehérje rekombináns úton történő előállítása és kötőhelyeinek tanulmányozása mutációk létrehozásával rendkívüli mértékben nehezített.

A vérben található oldható komplement fehérjék szintézise a D-faktor kivételével elsősorban a máj parenchyma sejtjeiben történik. Hepatociták termelik a szérum komplement 90%-át, de a monocita/makrofág rendszer sejtjei is sokféle komplement fehérjét szintetizálnak. A bazális szintézis a májjal összehasonlítva alacsony, de indukció hatására a komplement fehérjék termelése akár egy nagyságrenddel is emelkedhet. Különösen fontos lehet ez szöveti sérülés esetén kialakuló gyulladásos reakcióban (Ezekovitz és mtsai, 1984). Az epitél és endotél sejteken jelentős a komplement szabályozó membránfehérjék szintézise (van den Berg és mtsai, 1998). Az immunrendszer működése szempontjából kiemelkedő jelentőségűek a fago-citák, limfociták és az érfalak endotél sejtjeinek felszínén található komplement receptorok (Erdei, 1990; Prechl & Erdei, 2000).

A központi idegrendszerben mind neuronokban, mind glia sejtekben bizonyították komplement gének expresszióját. Asztrocita sejtek a hepatocitákhoz hasonlóan sokféle komplement fehérjét termelnek (Gasque és mtsai, 1985; Walker és mtsai, 1998). Mikroglia sejtek több, fagocitózissal összefüggő komplement receptorral rendelkeznek (Walker és mtsai, 1995).

A nem szabályozott és elhúzódó komplement aktiváció szerepet játszik számos emberi megbetegedés kialakulásában. Ezek közül az autoimmun betegségek mellett a legfontosabbak a miocardialis infarktus, a politrauma, a szepszis, valamint a központi idegrendszer demielinizációs (sclerosis multiplex), ischaemiás-perfúziós (stroke) és degeneratív (Alzheimer kór) megbetegedései. A klasszikus útvonal aktivációját figyelték meg antitestek kimutatható jelenléte nélkül akut szívizom infarktus és Alzheimer kór esetében is (McGeer & McGeer, 1998).

Az Alzheimer kór egy életkor-függő neurodegeneratív betegség, amely az időskori demenciák leggyakoribb formája. A betegség klasszikus klinikai tünetei közé tartoznak az amnéziás típusú memória zavarok, a beszéd romlása, a térlátás csökkenése, majd később a motoros és szenzoros zavarok, a járás és testtartás megváltozása és az agyvérzés. A betegség során magatartás zavarok is jelentkeznek.

A kór patológiájának három jellemzője az amiloid -peptid (A felhalmozódása extracellu-láris szenilis amiloid plakkokban, az idegsejtekben található finom rostrendszer összeguban-colódása a tau abnormális foszforilációja következtében (neurofibrillary tangles, NFT), és az agykéreg neuronjainak pusztulása. Az amiloid plakkok fő alkotói, a 39-43 aminosav hosszú-ságú A peptidek az amiloid prekurzor proteinből (APP) keletkeznek (Glenner & Wong, 1984; Masters és mtsai, 1985). Az A keletkezése és lerakódása oki kapcsolatba hozható a betegség kialakulásával, amit az alábbi megfigyelések támasztanak alá. Az Alzheimer kór korai megjelenésű típusában szenvedő betegek APP génjében (16. és 17. exon) több mutációt azonosítottak (Goate és mtsai, 1991). Down kóros betegekben az Alzheimer kór neuropatoló-giai jellemzői 40 éves korig csaknem mindig kialakulnak (Wisniewski és mtsai, 1985). Számos in vitro kísérlet igazolta, hogy az A neurotoxikus és sejtpusztulást okoz. APP túlter-melő transzgenikus egérben a betegségre jellemző amiloid plakkok alakulnak ki. Ezekben az egerekben tanulási és memória zavarok jelentkezhetnek. Az ApoE e4 genotípus az Alzheimer kór egyik fő rizikó-faktora és korai amiloid lerakódáshoz vezet (Roses, 1996). A fenti megfi-gyelések bizonyították, hogy az A központi szerepet játszik az Alzheimer kór kialakulásában (Cummings, 2004).
3.4.2 Alzheimer kórban kialakuló krónikus gyulladás

A kórra jellemző három patológiai vonás mellett a betegek agyában mindig megfigyel-hetőek a gyulladásos folyamatok és a veleszületett immunválasz következményei (Akiyama és mtsai, 2000; Wyss-Coray & Mucke, 2002). A gyulladásos folyamatok káros következmé-nyeire először egy epidemiológiai vizsgálat derített fényt, amelyben arthritises betegek között az Alzheimer kór alacsonyabb előfordulását figyelték meg. Mivel a legtöbb arthritises beteg nem-szteroid gyulladáscsökkentőt használt, azt a következtetést vonták le, hogy ezek a gyógyszerek csökkentik az Alzheimer kór kockázatát (McGeer és mtsai, 1990). Későbbi vizs-gálatok szerint a gyulladáscsökkentőt használók agyában háromszor kevesebb aktivált mikro-glia volt, mint az egészséges, gyógyszert nem szedők esetében (Mackenzie & Munoz, 1998). Ez arra utalt, hogy a nem-szteroid gyulladáscsökkentők gátolták a mikroglia aktivációt. Említésre méltó, hogy a gyulladáscsökkentőt használó arthritises betegek esetében nem változott az amiloid plakkok száma. A nem-szteroid gyulladáscsökkentők hatását a kór állatmodelljeiben is vizsgálták. Az első ilyen tanulmányban APP transzgenikus egerek ibuprofen kezelése csökkentette az amiloid plakkok számát, a mikroglia aktivációt a plakkok közelében, és az IL-1 túlsúlyt (Lim és mtsai, 2000).

Alzheimer kórban elhunyt betegek agyában a komplement kaszkád fehérjéi megtalál-hatóak a szenilis plakkok amiloid lerakódásaiban (Eikelenboom & Stam, 1982; McGeer és mtsai, 1989). A C1q normál körülmények csak nehezen mutatható ki az agyban, de Alzheimer kór korai stádiumában megjelenik a plakkok környezetében (Zanjani és mtsai, 2005). A betegség progressziójával a C1q a hippokampuszban idegsejteken és aktivált glia sejteken is kimutatható (Afagh és mtsai, 1996). A betegségben leginkább érintett kérgi területeken a C1q koncentrációja legalább egy nagyságrenddel megnő (Yasojima és mtsai, 1999). A klasszikus reakcióút aktivációját bizonyítják azok a megfigyelések, amelyek a klasszikus út fehérjéinek aktivációs fragmentumait mutatták ki szenilis plakkokban, pusztuló idegsejt nyúlványokon és az idegsejtek összegubancolódott finom rostrendszerén. Ugyanakkor az alternatív reakcióút B-faktora nem volt kimutatható (McGeer és mtsai, 1989; Brachova és mtsai, 1993).

Az érintett agyterületeken kimutatták a membránkárosító komplex jelenlétét is. A komplex kialakulása azt mutatja, hogy a komplementrendszert szabályozó mechanizmusok képtelenek voltak megállítani az aktivációt. A léziók helyén kimutatták komplement regulátor fehérjék jelenlétét is. Ez további bizonyíték a komplementrendszer aktivációjára a sérülések helyén, továbbá arra utal, hogy a szabályozásért felelős fehérjék csak kismértékben voltak képesek ellenőrzésük alatt tartani a komplement aktivációt (Yang és mtsai, 2000).

Láttuk, hogy a három komplement reakcióút bármelyikének aktivációja fontos része a sérülés, szöveti törmelék vagy mikroorganizmusok eltávolítását kísérő gyulladásos folyamatoknak. Ugyanakkor, a nem megfelelően szabályozott krónikus komplement aktiváció károsíthatja a saját szöveteket, különösen ott, ahol a sejtek alacsony szinten expresszálnak membránkötött komplement gátló fehérjéket. Ez magyarázza, hogy noha a komplement aktivációja nem közvetlen oka sok kórkép kialakulásának, de közvetlen szerepet játszik szöveti sérülések kialakulásában.

A betegség kialakulásában kulcsszerepet játszó A peptidről in vitro kimutatták, hogy köt a C1q molekulához, ami a klasszikus út aktivációját eredményezi (Rogers és mtsai, 1992). A klasszikus út jelentőségét támasztja alá az a megfigyelés, hogy az A aktiválja az alegységei-ből rekonstituált C1 komplexet (Tacnet-Delorme és mtsai, 1991). Az A ugyanakkor C3 kötésen keresztül aktiválja a komplement alternatív útját is (Bradt és mtsai, 1998). Ezek az in vitro megfigyelések azt sugallják, hogy az Alzheimer kórban megfigyelhető antitest-független komplement aktivációért az A felelős (Rogers és mtsai, 1992; McGeer & McGeer, 1998).
3.4.4 A komplement aktiváció szerepe a betegség állatmodelljeiben

Két évtized telt el azóta, hogy felmerült a gyanú a komplementrendszer érintettségére az Alzheimer kór patomechanizmusában (McGeer és mtsai, 1989). Ezzel összhangban voltak azok a megfigyelések, amelyek arra utaltak, hogy az A peptid antitestek távollétében aktiválja a komplement klasszikus reakcióútját in vitro (Rogers és mtsai, 1992). Mindazon-által, a komplement hozzájárulása az Alzheimer kórban tapasztalható neuronpusztuláshoz szelektív komplement gátlók hiányában nehezen bizonyítható. Több egér modellt is létrehoz-tak, amelyek az Alzheimer kórra jellemző neuropatológiai és magatartásváltozásokat mutat-ják. A Tg(HuAPP605.K670N-M671L)2576 egérben korfüggő amiloid lerakódást, mikroglia és asztroglia aktivációt és pusztuló nyúlványokat mutattak ki (Hsiao és mtsai, 1996).

A dupla transzgén APPPS1 (Tg2576 és mutáns presenilin 1 (PS1) keresztezése) egérben hamarabb keletkezik több A lerakódás, a plakkok környezetében aktivált glia sejtek és komplement fehérjék találhatóak (Matsuoka és mtsai, 2001). Az Alzheimer kór eme két általánosan használt egér modelljében C1q hiányt állítottak elő C1qKO (C1q-/-) egérrel való keresztezéssel (Botto és mtsai, 1998). Az előállított egerekben a C1q hiánya (APPQ-/- és APPPS1Q-/-) jelentősen csökkentette a Tg276 (APP) és az APP/PS1 egerekben tapasztalható mikroglia és asztroglia aktiváció mértékét és a neuronpusztulást (Fonseca és mtsai, 2004). Ezek az eredmények megerősítették azt az elképzelést, hogy az A által kiváltott C1 aktiváció, és a felszabaduló komplement anafilatoxinok központi szerepet játszanak a glia sejtek toborzásában. Továbbá az eredmények bizonyítják, hogy a C1q kötése A peptidhez gyulladásos reakciókat indít be a plakkok környezetében, amelyek idegsejtek funkcionális zavaraihoz majd pusztulásához vezetnek (McGeer & McGeer, 1998).

A PS1 és PS2 gének mutációja a familiáris Alzheimer kór leggyakoribb oka. Kondícionális, dupla KO egeret hoztak létre, amelyben mindkét PS hiányzik születés után az előagy glutamáterg neuronjaiban (Saura és mtsai, 2004). A PScDKO egérben memória csökkenést, a szinaptikus plaszticitás sérülését és az agykéreg neuronjainak pusztulását figyelték meg. Az agykéregben végzett microarray vizsgálatok több gyulladásos gén, köztük a C1q expresszió-jának jelentős emelkedését mutatták ki. Komplement aktivációra utaló aktivációs termékeket mutattak ki a hippokampuszban (Beglopoulos és mtsai, 2004).

Az eredményekből kitűnik, hogy az Alzheimer kórban fontos szerepet játszó génmutációk állatmodellekben kimutathatóan komplement aktivációt, mikroglia és asztroglia aktivációt és neuronpusztulást eredményeznek.



4 Célkitűzések
Kutatásaim a komplementrendszer központi idegrendszerben bekövetkező aktivációjának és következményeinek felderítésére irányultak. Munkám során az alábbi feladatokat és kérdések vizsgálatát tűztük ki:

1. 
   Ismert, hogy az amiloid -peptid aktiválja a komplementrendszert in vitro. Az aktiváció funkcionális hatásainak vizsgálatára egy in vitro sejtalapú rendszer kidolgozását tűztük ki.
   
2. 
   Az amiloid -peptid által kiváltott komplement aktivációhoz irodalmi adatok alapján mind a klasszikus, mind az alternatív út hozzájárul. Nem jelent meg azonban összefoglaló vizsgálat arról, hogy melyik útvonal játsza a főszerepet az aktiváció során. Ezt a kérdést egy endogén komplement inhibítor, a C1-Inh hatásának vizsgálatával kívántuk tanulmányozni.
   
3. 
   A központi idegrendszerben található komplement komponensek nagyrészét az agy szöveti makrofágja, a mikroglia termeli. Különböző komplement gének kifejeződését vizsgáltuk kezeletlen és lipopoliszachariddal kezelt mikroglia sejtekben in vitro.
   
4. 
   Mára egyetértés alakult ki abban, hogy az amiloid -peptid oki szerepet játszik az Alzheimer kór kialakulásában. Vizsgálni kívántuk, hogy a peptid befolyásolja-e korai komplement gének átíródását mikroglia sejtekben in vitro.
   
5. 
   Az aktivációért felelős útvonal és a mikrogliális expresszió ismeretében egy farmakológiai beavatkozásra alkalmas támadáspontot kell kiválasztanunk, amelynek révén szelektíven gátolható a komplement aktiváció.
   
6. 
   A szakirodalomban kevés komplement inhibítort írtak le, klinikán pedig nincs szelektív, kis molekulatömegű komplementgátló. Ezért célul tűztük ki ismert vegyületek tanulmányozását a kiválasztott támadáspontú vegyület funkciójára.
   
7. 
   A Társaság tulajdonában levő vegyülettár mérete és szerkezeti diverzitása révén alkalmas lehet új kémiai szerkezetek azonosítására. Egy nagy áteresztőképességű módszer beállítása és validálása után célul tűztük ki a vegyülettár szűrését, és kémiai optimalizálás után vezérmolekula kiválasztását.
   
8. 
   A kiválasztott vegyületet hatékonyságának és szelektivitásának vizsgálata.
   
9. 
   A vezérmolekula egy molekula részlethez kötődve fejti ki a hatását. Tanulmányozni kívánjuk, hogy a vegyület melyik, a kölcsönhatásban résztvevő fehérje molekulához köt.
   
10. 
    A vezérmolekula szelektíven gátolja a komplement aktiváció valamelyik lépését. In vitro sejtalapú tesztben vizsgálni kívánjuk, hogy a molekula felfüggeszti-e a komplement toxikus hatását az idegsejtekre.
    

Primer egér mikroglia tenyészeteket újszülött NMRI egerek agyából készítettünk egy általánosan használt módszert (Suzumura és mtsai, 1987) követve. Az agyakat kivettük a koponyából és D-oldatban (90 ml PBS pufferben oldunk 99 mg glükózt, 2,017 g szacharózt, plussz 0,2 ml antibiotic antimycotic solution (Sigma), pH5,5) felszuszpendáltuk. Tripszines kezelést (2 ml tripszin-EDTA, 37^oC, 5 perc) követően DNase oldatot (8 mg DNase I / 50 ml D-oldat) adtunk a sejtekhez, és 5 percig inkubáltuk 37^oC-on. A szuszpenziót 30 ml-re egészí-tettük DMEM (1,2 g/l NaHCO₃ és 1,5 g/l glükóz tartalmú DMEM, pH7,2) tápfolyadékkal, majd a sejteket lecentrifugáltuk. A sejteket 5 ml 10% FCS-DMEM oldatban felszuszpendál-tuk, és szűréssel tovább homogenizáltuk. A sejtszuszpenziót tápfolyadékot tartalmazó 75 cm² szövettenyésztő edényekbe tettük. Egy hét múlva a médiumot lecseréltük. Ezzel a módszerrel 10 nap után konfluens kultúrákat kaptunk. A kevert glia kultúrából a mikroglia sejteket gyengébb adhéziós tulajdonságuk alapján választottuk el. A benőtt edényeket rázóasztalon rázattuk 125 rpm mellett 2 órát. A mikroglia tartalmú tápfolyadékot összegyűjtöttük, és a visszamaradt asztrogliára friss tápfolyadékot adtunk. A mikroglia sejteket lecentrifugáltuk, majd 5 ml kondícionált médiumban felszuszpendáltuk. A sejtszám meghatározása után a mikrogliát megfelelő tenyésztő edénybe tettük (kezelésekhez a sejteket általában 24 kamrás műanyag edényekben tenyésztettük). Kitapadás után a sejteket kondícionált médiummal mostuk, és szérummentes DMEM/ITS tápfolyadékban tenyésztettük. CD18 festés alapján a sejtek több mint 95%-át találtuk mikrogliának.

Primer patkány hippokampális sejttenyészeteket újszülött Wistar patkányok agyából készítettünk egy korábban kidolgozott eljárás alapján (Nagy & László, 2002). A sejteket komplement toxicitás vizsgálatokra 6, míg RT-PCR vizsgálatokra 24 kamrás műanyag edényekben tenyésztettük.
5.2 RNS izolálás, fordított (reverz) transzkripció

A sejteket kezelés után PBS-sel mostuk, majd totál RNS-t izoláltunk a Stratagene RNS izoláló kitjével a gyártó által javasolt recept alapján. A minták integritását agaróz gélben vizsgáltuk etidium-bromid festést követően. Az RNS koncentrációkat 260nm-en mért abszorpcióval határoztuk meg. Azonos mennyiségű RNS mintákat fordítottunk át cDNS-sé RNáz inhibítor jelenlétében MuLV reverz transzkriptáz (Stratagene) enzimmel. A reakciót 37 ^oC-on 60 percig végeztük, majd 90 ^oC-ra történő melegítéssel állítottuk le.

A polimeráz láncreakciót 50l térfogatban, 10mM Tris-HCl pH8,3 pufferben 50mM KCl, 0,2mM dNTP, 1,5mM MgCl2, 1mM primer és 1 egység Tag DNS polimeráz (Stratagene) jelenlétében végeztük Hybaid Thermocycler készülékben. A reakciót általánosan használt paraméterekkel, 25x (94^oC 30 másodperc, 60^oC 30 másodperc, 72^oC 1 perc) futtatva egy 10 perces extenziós idő után fejeztük be. A tervezett komplement oligonukleotid primereket az IDT cégtől vásároltuk. A vizsgált komplement komponens mellett a -aktint is minden esetben koamplifikáltuk. A PCR termékeket 2% agaróz gélen elektroforézissel szétválasz-tottuk, majd etidium-bromiddal festettük. A PCR termékeknek megfelelő sávok intenzitását Grab It 2.35 és Gel Works képanalizáló szoftverek (UVP) segítségével határoztuk meg. A komplement mRNS szinteket a -aktin mRNS szintjével normalizáltuk. A komplement expresszió vizsgálatára tervezett primerek a következők voltak:

A mikrotiter lemezek borítását és a C1q kötést egy közölt leírás módosítása alapján végeztük (Jiang és mtsai, 1994). Röviden, az amiloid- peptideket DMSO-ban oldottuk és készítettünk törzsoldatokat. A törzsoldatokat -20^oC-on tároltuk. A peptidet csak közvetlenül használat előtt hígítottuk vizes pufferben. Maxisorp (Nunc) mikrotiter lemezeket borítottunk 10 g/ml amiloid- oldattal 0,1mM Tris pH 8,5 pufferben100 l/kamra térfogatban 16 órát

4 ^oC-on. 0,05% Tween20 –tartalmú PBS-es mosás után a lemezt 30 percet blokkoltuk PBS-ben oldott 3% BSA-val. A C1q kötést szobahőmérsékleten végeztük 60 percig a jelzett koncentrációban. A lemezt háromszor mostuk (3 x 10 perc), majd a kötött C1q mennyiségét standard ELISA módszerrel határoztuk meg. A C1q-t anti-humán C1q antitesttel reagáltattuk, majd biotin-jelzett második antitestet, és Extravidin-HRPO-t (Sigma) használtunk. Az enzim mennyiségét TMB szubsztrát hasítása alapján határoztuk meg. A mérést TecanSpectra fotométeren végeztük 450 nm-en.

Az antitest-C1q kötési vizsgálatban a lemezt 10 mg/ml ovalbuminnal borítottuk 4 ^oC-on. Az antigén fölösleg eltávolítása után immunkomplexet képeztünk anti-ovalbumin 1:400 hígítású oldatával. A C1q kötést és és mennyiségi meghatározást a fent leírtak szerint végeztük.

A komplement C1q fehérjét a Calbiochem és a Quidel cégektől szereztük be. Az A peptide-ket a Bachemtől, a SAP és CRP fehérjéket a Calbiochemtől vásároltuk. A komplement fehér-jék ellen termelt primer antitestek Calbiochem, Serotec vagy Quidel termékek voltak.

A farmakológiailag aktív vegyületek RBI könyvtára a Sigma által forgalmazott termék.

A komplement-függő A toxicitás mérést egy közölt módszert módosítva végeztük (Schultz és mtsai, 1994). Röviden, egy héttel lemezelés után a hippokampális sejtek morfoló-giáját ellenőriztük. Ahol nagyobb méretű fagocitózist, vagy fejletlen nyúlványokat láttunk, azokat a lemezeket nem használtuk a továbbiakban. Kezelések előtt a tápfolyadékot szérum-mentes N2 médiumra cseréltük. Komplement aktivátorként A1-40 peptidet, kontrollként a fordított A40-1 peptidet használtuk. A peptideket használat előtt DMSO-ban oldottuk, majd tápfolyadékban hígítottuk a kívánt koncentrációra (0,8 mM). Friss, normál humán szérumot használtunk komplement forrásként. 25l A törzsoldat és 15l normál humán szérum került minden kamrába, ami 40M A és 3% szérum koncentrációt eredményezett. A toxicitást a tápfolyadékban mérhető LDH aktivitás alapján határoztuk meg Cytotoxicity Detection kittel (Roche Diagnostics).

A tömegspektrumokat Finnigan MAT 95SQ tandem spektrométeren elektrospray ionizációs forrást használva vettük fel (Skribanek és mtsai, 2001). A vizsgálatban N2 védő-gázt használtunk, 3kV spray feszültség és 70V feszültség mellett. Az anyagok oldására 2mM CH₃CO₂NH₄ – 0,5% ecetsav (v/v) 1:1 elegyét használtuk. 20 l mintát injektáltunk az eluens áramba, áramlási sebesség 50 l.

Az A1-40 peptid aktiválja a komplementrendszert in vitro (Rogers és mtsai, 1992). Az aktiváció sejtszintű következményeiről kevés adat állt rendelkezésre, ezért az aktiváció hatását tanulmányoztuk patkány újszülött hippokampális sejteken. Irodalmi adatokkal összhangban megállapítottuk, hogy az A1-40 peptid és a normál humán szérum önmagában nem okozott sejtpusztulást (Schultz és mtsai, 1994). A komplement forrás (humán szérum) és a komplement aktivátor (A1-40) együtt azonban növekvő, 5 nap után 30% citotoxicitást eredményezett, amit LDH felszabadulás alapján határoztunk meg (Sárvári és mtsai, 2003). Különösen a neuronok érzékenyek komplement lízisre, mivel primer glia sejteken a fenti kezelés nem okozott sejtpusztulást (Sárvári és mtsai, 2003).

Miután megerősítettük az A1-40 indukálta komplement citotoxikus hatását hippo-kampális sejteken, a klasszikus úton történő aktiváció hozzájárulását vizsgáltuk a beállított módszerrel. A C1r és C1s alegységek egyetlen szabályozó molekulája a C1-Inh. A klasszikus út endogén regulátorának védő hatását vizsgáltuk A1-40 peptiddel és normál szérummal kezelt primer patkány hippokampális sejteken. Megállapítottuk, hogy 0,1 egység C1-Inh közel 50%-kal, tehát 15%-ra, míg 0,5 egység közel 90%-kal, tehát 3%-ra csökkentette az A1-40 által kiváltott komplement toxicitást (Sárvári és mtsai, 2003). A maradék toxicitás valószínű-leg az alternatív út hozzájárulása lehetett. Az eredmény azt mutatta, hogy a választott modell-ben az A túlnyomórészt a klasszikus reakcióúton keresztül aktiválta a komplementrendszert.