Amiloid -peptid által indukált komplement
aktiváció gátlása kis molekulatömegű szintetikus vegyületekkel in vitro
Készítette: Dr. Sárvári Miklós
Richter Gedeon Vegyészeti Gyár Nyrt.
Témavezető: Dr. Sass Miklós, egyetemi tanár
ELTE, TTK,
Anatómiai, Sejt- és Fejlődésbiológiai Tanszék
BIOLÓGIAI DOKTORI ISKOLA
Vezető: Dr. Erdei Anna, akadémikus
MOLEKULÁRIS SEJT- ÉS NEUROBIOLÓGIAI DOKTORI PROGRAM
Vezető: Dr. Sass Miklós, egyetemi tanár
Köszönetnyilvánítás
Ezúton mondok köszönetet Sass Miklós professzor úrnak, témavezetőmnek, hogy bátorított a doktori programban való részvételre. Köszönöm segítségét és támogatását, szakmai tanácsait, amelyekkel munkámat segítette.
Köszönöm volt főosztályvezetőm, Dr. Lőw Miklós, és osztályvezetőm, Dr. Pázmány Tamás támogatását, amellyel a Társaságnál futó komplement kutatásokat segítették.
Köszönettel tartozom volt vezetőimnek, köztük elsősorban Závodszky Péter professzor úrnak, hogy bevezetett a tudományos kutatás világába. Köszönöm Alfred F. Esser professzor úrnak, hogy amerikai ösztöndíjas éveim során segített, és a komplementrendszer újabb arcát ismertette meg velem.
Köszönöm technikus kollégám, Bozonász Irini pontos és lelkiismeretes munkáját.
Végül, de nem utolsósorban köszönöm jelenlegi, és volt munkatársaim: Dr. Ambrus Géza, Dr. Cseh Sándor, Dr. Gál Péter, Kósa János, Lehotzky Attila, Dr. Likó István, Dr. Lőrincz Zsolt, Dr. Mák Mariann, Szilágyi Katalin, Dr. Tóth Szilvia, Dr. Urbányi Zoltán, Dr. Villar Maite, Dr. Wang Yunxia segítőkészségét és támogatását.
Köszönöm családom türelmes megértését, amellyel a kutatói életformából adódó nehézsége-ket elviselték, és örömüket, amellyel örömeimben osztoztak.
Tartalomjegyzék
1 ÖSSZEFOGLALÁS 5
2 SUMMARY 6
3 BEVEZETÉS 8
3.1 A komplementrendszer aktivációja és szabályozása 9
3.1.1 A klasszikus reakcióút 9
3.1.2 Az alternatív reakcióút 12
3.1.3 A lektin reakcióút 13
3.1.4 C3, a komplementrendszer központi molekulája 14
3.1.5 A C5 aktivációja 14
3.1.6 A membránkárosító komplex kialakulása a terminális fázisban 15
3.1.7 A komplementrendszer szabályozása 16
3.2 Komplement fehérjék bioszintézise 18
3.3 A komplementrendszer aktivációja betegségekben 18
3.4 A komplement aktiváció szerepe az Alzheimer kór kialakulásában
3.4.1 Az Alzheimer kór 19
3.4.2 Alzheimer kórban kialakuló krónikus gyulladás 19
3.4.3 A komplement szerepe az Alzheimer kór patogenezisében 21
3.4.4 A komplement aktiváció a betegség állatmodelljeiben 22
4 CÉLKITŰZÉSEK 23
5 ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
5.1 Sejttenyészetek és jellemzésük 25
5.2 RNS izolálás és reverz transzkripció 26
5.3 Polimeráz láncreakció 26
5.4 Szilárd fázisú kötési vizsgálat 27
5.5 Komplement toxicitási teszt 28
5.6 Tömegspektrometria 28
6 EREDMÉNYEK
6.1 Komplement aktiváció citotoxikus hatásainak kimutatása in vitro 29
6.2 C1-Inh felfüggeszti a komplement közvetített citotoxicitást 30
6.3 Komplement gének expressziója glia sejtekben
6.3.1 Komplement gének transzkripciója mikroglia sejtekben 31
6.3.2 Komplement génkifejeződés változása gyulladásos stimulus hatására 32
6.3.3 A peptid hatása C1q és C1-Inh gének átíródására 34
6.4 A C1q és A közötti kölcsönhatás tanulmányozása
6.4.1 Humán és egér C1q kötése az A peptidhez 37
6.4.2 Az ionerősség hatása 38
6.5 C1q kötést gátló ismert vegyületek
6.5.1 Glikózaminoglikánok 39
6.5.2 RBI vegyületkönyvtár 40
6.6 C1q kötést gátló új szintetikus vegyületek 41
7 EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE
7.1 A komplement aktiváció biológiai jelentősége 46
7.2 A peptid által kiváltott komplement aktiváció 48
7.3 Az A peptid által kiváltott aktiváció a klasszikus úton történik 49
7.4 C1q, a szelektív komplement gátlás lehetséges molekuláris célpontja 50
7.5 Valószínűleg nem az A14-26 régió a C1q A kötőhelye 51
7.6 A komplement gátlás lehetséges terápiás előnyei és hátrányai 52
7.7 Komplement aktiváció gátlása sclerosis multiplex kezelésére 53
8 CÉLKITŰZÉSEK MEGVALÓSULÁSA 55
9 SAJÁT KÖZLEMÉNYEK 57
10 IRODALMI HIVATKOZÁSOK 59
1 Összefoglalás
Az utóbbi évek preklinikai és klinikai kutatási eredményei szerint az agy neuroimmunológiai folyamatai fontos szerepet játszanak a neurodegeneratív betegségek kialakulásában. Ezekben a folyamatokban a komplementrendszer, az asztroglia és mikroglia sejtek központi szerepet játszanak. A krónikus komplement aktiváció jelenléte az agyban az időskori demenciák, köztük az Alzheimer kór egyik közös jellemzője. Több, az egyes betegségekre jellemző fehérje természetű komplement aktivátort azonosítottak. A komplement első komponensének q alegysége (C1q) köt az amiloid -peptidhez, ami oki kapcsolatba hozható az Alzheimer kór kialakulásával. A két fehérje közötti kölcsönhatásnak három funkcionális következménye van in vitro. A C1q kötés hatására legalább egy nagyságrenddel megnő az amiloid -peptid aggregációja. A C1q beépülése az amiloid aggregátumokba megnehezíti azok fagocitózisát az agy szöveti makrofágja, a mikroglia számára. Végül, de nem utolsósorban a kölcsönhatás a komplement klasszikus útjának antitest-független aktivációját eredményezi. Mindez azt sugallja, hogy az Alzheimer kór patológiájában elsősorban a klasszikus útnak van jelentősége, noha az amiloid -peptid aktiválja a komplement alternatív útját is. A komplement aktiváció toxikus hatásai ellen szolubilis és membránkötött fehérjék védik a szervezet saját sejtjeit. Az elhúzódó komplement aktiváció az agyban különösen veszélyes, mert egyes agyterületeken, különösen a kéregben, a komplement regulátor fehérjék alacsony szintje védtelenné teszi az idegsejteket a membránkárosító komplex kialakulásával szemben. Kutatásaim az aktiváció útvonalának felderítésére, és szelektív komplement gátlók kifejlesztésére irányultak.
Megállapítottuk, hogy komplement forrás jelenlétében az amiloid -peptid hippokampális sej-tek pusztulását okozta in vitro. A klasszikus aktivációs útvonal endogén szabályozó molekulá-ja, a C1 inhibítor, a citotoxikus hatást felfüggesztette. In vitro kísérletekben kimutattuk, hogy mikroglia sejtekben állandó C1q szintézis folyik. Irodalmi adatokkal összhangban ez arra utalt, hogy a C1q fehérje intakt vér-agy gát mellett is állandóan jelen van az agyban. A C1q fehérjét molekuláris célpontnak választva olyan ismert vegyületeket azonosítottunk, amelyek gátolták a C1q kötést amiloid -peptidhez. Ezek a vegyületek ugyanakkor nem gátolták a C1q kötést az antitestek Fc régiójához. Ez az eredmény bizonyította, hogy a C1q molekulán szelektíven gátolható az amiloid -peptid kötőhely. A Társaság vegyülettárából olyan molekulákat azonosítottunk, amelyek gátolták a C1q kötést amiloid -peptidhez. A 308 vegyület közül 301 nem befolyásolta a C1q kötést immunkomplexben levő antitestek Fc régiójához. A 308 vegyület közül 56 gátolta a C1q kötést C-reaktív proteinhez, és 35 mielin bázikus fehérjéhez. Kémiai optimalizálás után vezérmolekulát állítottunk elő. A vegyület mikromoláris koncentráció alatt gátolta a C1q kötést amiloid -peptidhez, C-reaktív protein-hez és mielin bázikus fehérjéhez. Szelektivitási vizsgálatokban megállapítottuk, hogy a vezér-molekula nem gátolta a C1q kötést antitestek Fc régiójához, és a szérum amiloid P kötést amiloid -peptidhez. ESI-MS kísérlettel igazoltuk, hogy a vegyület nem köt amiloid -peptid-hez, tehát a C1q amiloid kötőhelyén keresztül gátolja a C1q kötést. A vezérmolekula a beállított sejtalapú tesztben gátolta a komplement aktivációt és megvédte a hippokampális sejteket a komplement-függő amiloid -peptid toxicitás ellen. A vegyület szerkezete alapján várható, hogy átjut a vér-agy gáton és jelentős agyszint érhető el in vivo.
Több kísérlet igazolta, hogy a komplementrendszer antitest-független aktivációja szerepet játszik a kísérleti úton kiváltott autoimmun encephalomyelitis, a sclerosis multiplex állatmo-delljében tapasztalható gyulladás kialakulásában és idegsejt pusztulásban. Ez felvetette annak lehetőségét, hogy a vegyületet sclerosis multiplex különböző modelljeiben is vizsgáljuk.
2 Summary
Recent preclinical and clinical studies have demonstrated that neuroimmune processes of the brain play important role in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. These neuro-immune processes include the complement system, microglia and astrocytes. Ample evidence implicates the involvement of the complement system in the pathology of several neuro-degenerative diseases including Alzheimer’s disease (AD). Residential brain cells, including neurons, astrocytes and microglia, synthesize proteins of the complement system, so complement involvement does not depend on disruption of the blood-brain barrier. Complement synthesis is upregulated in AD brain and complement proteins, including C1q are associated with senile plaques, one of the pathological hallmarks of AD. C1q, the recog-nition subunit of the classical pathway binds to amyloid -peptide (A), the major constituent of these plaques. The interaction between the two proteins has three functional consequences in vitro. As a result of C1q binding, aggregation of A is enhanced by an order of magnitude. Incorporation of C1q onto amyloid fibrils blocks the uptake of A by microglia. Most importantly, C1q binding to A results in activation of the classical pathway in an antibody-independent manner. It suggests that in AD pathology the classical pathway bears particular importance, although A activates the alternative pathway of complement via binding to C3 as well.
Host tissue is protected against the toxic effect of complement activation by soluble and membrane-associated regulators. Neurons in the hippocampus and cortex express low levels of most complement regulators, which makes them susceptible to complement-mediated damage. Indeed, the end product of the terminal pathway, the membrane attack complex has been detected on dystrophic neurites and damaged cells in AD brain by several laboratories. These results provide solid evidence that A peptides, produced and accumulated in AD brain, drive sustained activation of the complement system resulting in destruction of complement-sensitive neurons.Although the pathogenic potential of this powerful effector mechanism has been recognized, a complement inhibitor is still lacking from the therapeutic arsenal.
The aim of this project was to identify the major route of A-induced complement activation and to develop selective inhibitors of the complement system. We showed that A in the presence of complement damaged hippocampal cells in vitro. The endogenous inhibitor of the classical pathway, C1-Inh suspended the toxic effect. We selected C1q as molecular target and identified synthetic compounds that inhibited C1q binding to A, but not to antibodies. These compounds inhibited C1q binding to other non-immunoglobulin activators such as C-reactive protein, serum amyloid P and myelin basic protein as well. Based on these results, it is likely that C1q possess the same binding site for non-immunoglobulin activators.
Recent studies on a mouse model of multiple sclerosis, experimental autoimmune encephalo-myelitis (EAE) implicate myelin induced complement activation in the pathology of the disease. These results warrant the study of the lead compound in various models of multiple sclerosis. This can provide further information on the role of pathological complement activation in various forms of multiple sclerosis and reveal the benefits of its inhibition via C1q.
3 Bevezetés
A komplement a veleszületett immunitás nem antigénspecifikus végrehajtó rendszere, amely elsősorban az extracelluláris patogének ellen irányul. A komplementrendszert mintegy 30 fehérje, proteázok, speciális funkciójú fehérjék, inhibítorok és receptorfehérjék alkotják. A rendszer működése alapján három szakaszra bontható, aktivációs, központi és terminális fázisra. Az aktiváció három független útvonalon, klasszikus, lektin és alternatív reakcióúton történhet, és mindhárom a komplement központi, C3 komponensének hasításához vezet. A központi szakaszban a C3 és a C5 aktivációja során több, kulcsfontosságú hasítási termék szabadul fel. A terminális szakasz során egy litikus, C5b-9 összetételű membránkárosító komplex keletkezik.
1. ábra A komplementrendszer felépítése. A kaszkád három útvonalon aktiválódhat, az aktivációs utak a C3 hasításánál futnak össze. A központi szakaszban felszabaduló kisméretű C3a és C5a fragmentumok hatékony gyulladásserkentők, míg a nagy C3b fragmentum kovalensen kapcsolódik a célsejt membránjához (opszonizáció). A terminális fázisban alakul ki a C5b-9 összetételű membránkárosító komplex.
3.1 A komplementrendszer aktivációja és szabályozása
3.1.1 A klasszikus reakcióút
A komplement aktiválódásának legkorábban leírt módja a klasszikus aktivációs út. A reakcióút beindításának legismertebb példája a komplement első komponensének (C1) anti-testek által történő aktivációja. Az aktivációt a C1q antigénnel kapcsolódott antitestek Fc régióihoz történő kötése váltja ki (Schumaker és mtsai, 1987). A C1q alegység 18 polipeptid láncból (6A, 6B és 6C) épül fel, amelyek N-terminálisa egy 81 aminosav hosszúságú (-Gly-Xaa-Yaa-)27 kollagénszerű szekvenciát , C-terminálisa egy 136 aminosavból álló globuláris szakaszt tartalmaz (Reid & Porter, 1976). A kollagénszerű szakasz feléig a hármas hélixek párhuzamosan futnak, majd szétválnak és kúpszerűen távolodnak egymástól. A kollagén szárak globuláris doménekben végződnek. A C1q elektronmikroszkóppal megfigyelt szerke-zete egy hat szál tulipánból álló csokorra emlékeztet (2. ábra). A globuláris domének felelnek meg a tulipánfejeknek, míg a kollagénszerű szerkezet a száraknak. A globuláris fejek és a kollagén szárak egy része tölcsért formál. Itt, a szárak között helyezkednek el a C1 komplex további tagjai, a C1r és C1s alegységek (Tosi és mtsai, 1987; Sárvári és mtsai, 1990). Az enzimatikus funkciót hordozó alegységek C1r2s2 összetételű komplexet alkotnak, amelyet Ca++ stabilizál.
| 