START Po zarejestrowaniu woltamperogramu należy zapisać uzyskane wyniki. W tym celu należy przejść do menu: Curve -> Save curve

11. 
    Po zarejestrowaniu woltamperogramu należy zapisać uzyskane wyniki. W tym celu należy przejść do menu: Curve -> Save curve.., co powoduje pojawienie się okna dialogowego z komunikatem (Rys.4, krok 1,2,3).
    

Okno to pozwala zachować dane z wykonania pomiaru. Najpierw w oknie dialogowym należy odszukać znajdujący się na pulpicie (ikona z lewej strony) - katalog STUDENCI, następnie utworzyć nowy folder. W polu nazwa pliku wpisać swoje nazwisko (np. Kowalski), otworzyć utworzony folder, a następnie w miejscu Nazwa pliku (Rys.4.) należy wpisywać swoje nazwisko oraz numer porządkowy woltamperogramu, np. Kowalski1.

12. 
    Następnie należy zmierzyć wartość natężenia prądu otrzymanego piku soku jabłkowego oraz odczytać ich potencjały. W tym celu należy wejść do menu Plot oraz włączyć ikonę, jak pokazano na Rys.5. Opcja ta umożliwia odczytanie potencjałów pików i wartości natężeń prądów pików. Po wybraniu tej opcji na ekranie pojawia się następujące okno dialogowe z danymi (Rys.5, krok 1,2,3). W przypadku, gdy sygnały nie zostaną automatycznie odmierzone przez program, należy odmierzyć je ręcznie.
    

13. 
    Odczytane wartości potencjałów pików (zapisać w tabeli w miliwoltach!) oraz wartości natężeń prądów pików (w mikroamperach) należy umieścić w tabeli:
    

Kolejnym etapem jest zarejestrowanie trzech woltamperogramów po trzykrotnym dodatku wzorca kwasu askorbinowego do analizowanej próbki. W tym celu do naczynka woltamperometrycznego należy wprowadzić pipetami automatycznymi przez otwór w teflonowej pokrywie kolejno po: 30.00; 45.00; 75.00 µl roztworu wzorcowego kwasu askorbinowego o stężeniu 0.01 mol L^-1.

14. 
    Po dodatku roztworu wzorcowego kwasu askorbinowego do analizowanej próbki należy odczekać 3 minuty, po czym wyłączyć mieszanie, a następnie zarejestrować kolejne woltamperogramy – w tym celu przejdź do punktu i.
    
15. 
    Po zarejestrowaniu kolejnego woltamperogramu należy zapisać wyniki (patrz punkt k.) oraz zmierzyć potencjały pików, wartości natężeń prądu (patrz punkt l.), a następnie wyniki zapisać w Tabelce (patrz punkt m.).
    
16. 
    Po wykonaniu analizy próbek należy dokładnie umyć wodą destylowaną układ elektrod. Nasyconą elektrodę kalomelową należy umieścić w nasyconym roztworze KCl. Wyłączyć program (przejść do menu Method -> Exit), sterownik elektrod, komputer. Wyłączyć listwę zasilającą.
    

4. 
   Opracowanie wyników
   

1. 
   Wykonać wykres właściwy dla metody wielokrotnego dodatku wzorca.
   
2. 
   Obliczyć zawartość kwasu askorbinowego w mg/l (witaminy C) w soku jabłkowyn „Cappy”. Zinterpretować uzyskane wyniki.
   

5. 
   Środki ostrożności
   

1. 
   W trakcie wykonywania ćwiczenia student powinien nosić odzież ochronną.
   
2. 
   Roztworów nie należy wdychać i pipetować ustami.
   
3. 
   Identyfikacja zagrożeń:
   

4. 
   Pierwsza pomoc:
   

- w przypadku wystąpienia podrażnień skontaktować się z lekarzem.

- w razie spożycia: przepłukać usta wodą, podać do wypicia niewielką ilość wody
i skontaktować się z lekarzem

S1 - WYZNACZANIE AKTYWNOŚCI AMYLAZY W ŚLINIE
Amylaza jest enzymem występującym w ślinie i soku trzustkowym, który katalizuje hydrolityczny rozkład wiązań -glikozydowych w polisacharydach takich jak skrobia, glikogen oraz produkty ich rozpadu. Początkowo skrobia jest rozbijana na amylodekstryny, a w miarę postępu reakcji enzymatycznej hydrolizy powstają dekstryny. Końcowymi produktami są maltoza i glukoza. Optymalne pH działania enzymu wynosi 6.9-7.0. Inhibitorami hydrolizy skrobi są jony jodkowe, fluorkowe, cytrynianowe i szczawianowe. Aktywatorami natomiast są jony chlorkowe.

Skrobia oraz amylodekstryny zawierające powyżej 30 reszt glukozowych w łańcuchu tworzą z jodem addycyjne połączenie o charakterystycznym niebieskim zabarwieniu. Zmiana stężenia substratów jest proporcjonalna do aktywności amylazy. Badanie aktywności amylazy w materiałach biologicznych pobranych od pacjentów (mocz, krew, ślina) ma znaczenie diagnostyczne w niektórych chorobach.

Aktywność enzymu może być wyrażona w katalach (kat), jednostkach Somogyi (JS) lub w jednostkach enzymatycznych (U). Katal jest to aktywność, która przekształca 1 mol substratu (w ćwiczeniu skrobi) w czasie 1 s - mianem katala jest zatem mol·s^-1. Katal jest jednostką bardzo dużą i z reguły aktywność enzymu wyraża się w mikrokatalach (kat) lub nanokatalach (nkat). JS jest to aktywność amylazy zawartej w 100 ml badanego materiału, która katalizuje hydrolizę 10 mg skrobi w czasie 30 min., do związków niebarwiących skrobi. Jednostka enzymatyczna odpowiada ilości enzymu przekształcającemu 1 mikromol substratu w czasie 1 minuty. Obecnie zalecaną jednostką aktywności enzymatycznej w układzie SI jest katal.

Celem ćwiczenia jest zbadanie aktywności amylazy zawartej w ślinie oraz wpływu na nią temperatury, jonów chlorkowych, cytrynianowych oraz alkoholu.

roztwór skrobi - 0.05%, pH 6.9-7.0,

roztwór jodu – 1% w 2% KI,

roztwór chlorku sodu o stężeniu c(NaCl) = 0.01 mol/l,

roztwór cytrynianu sodu c(Na₃C₆H₅O₇) = 0.01 mol/l,

alkohol etylowy.

UWAGA: WE WSZYSTKICH POMIARACH ODNOŚNIKIEM JEST WODA DESTYLOWANA

PRZED KAŻDYM POMIAREM ABSORBANCJI ROZTWORU BADANEGO SPEKTROFOTOMETR NALEŻY WYZEROWAĆ WZGLĘDEM ODNOŚNIKA.

5. Po upływie 10 min. od wprowadzenia roztworu śliny do kolbki B2 wprowadzić do niej 1 ml roztworu jodu. Kolbkę uzupełnić wodą destylowaną do kreski, dobrze wymieszać i przeprowadzić pomiar absorbancji.

6. Po 10 min. termostatowania do kolbki B1 wprowadzić 10 l roztworu śliny. Zawartość kolbki delikatnie wymieszać i wstawić ją na 10 min. do termostatowania w temp. 37^oC.

Do kolbki K1 wprowadzić 1 ml roztworu jodu i uzupełnić ją wodą do kreski. Zawartość kolbki dobrze wymieszać i zmierzyć absorbancję roztworu.

Po zakończeniu autodiagnostyki na ekranie wyświetli się menu główne (Main Menu).

Na panelu sterowania nacisnąć przycisk . W prawym górnym rogu ekranu wyświetla się Ref. in?.

Jedną z kuwet uzupełnić w ok. ¾ objętości odnośnikiem (wodą destylowaną), ścianki dobrze wytrzeć ligniną w celu usunięcia kropli roztworu i zanieczyszczeń, a następnie umieścić ją w celce numer 1 spektrofotometru. Sprawdzić czy gałka przesuwająca wózek z kuwetami jest dosunięta do końca (pozycja 1).

Nacisnąć przycisk aby rozpocząć pomiar. W prawym górnym rogu ekranu wyświetla się Measuring.

Po zakończeniu pomiaru dla odnośnika w prawym górnym rogu ekranu wyświetla się Sample in?.

Gałkę przesuwającą wózek z kuwetami wysunąć do pozycji 2 odpowiadającej celce numer 2, w której zostanie umieszczona kuweta z roztworem badanym. Kuwetę tę przepłukać porcją roztworu badanego, uzupełnić ją tym roztworem w ok. ¾ objętości, ścianki dobrze wytrzeć ligniną w celu usunięcia kropli roztworu i zanieczyszczeń, a następnie umieścić ją w celce numer 2 spektrofotometru.

Rozpocząć pomiar absorbancji próbki naciskając przycisk . Na ekranie wyświetla się Measuring oraz wartość absorbancji.

Aby przeprowadzić kolejny pomiar należy nacisnąć przycisk . W prawym górnym rogu ekranu wyświetla się Ref. again?. Naciśnięcie przycisku powoduje wyświetlenie Ref. in?. Wózek z kuwetami ustawić w pozycji odnośnika i nacisnąć przycisk aby wyzerować spektrofotometr. Następnie zmierzyć absorbancje kolejnego roztworu badanego (celka nr 2) w sposób analogiczny do opisanego powyżej.

UWAGA! PRÓBKĄ KONTROLNĄ DLA TEJ CZĘŚCI ĆWICZENIA JEST PRÓBKA K1,

ODNOŚNIKIEM JEST NADAL WODA DESTYLOWANA

Opracowanie wyników

1. Obliczyć aktywność amylazy w:

katalach/l wg wzoru:

- jednostkach Somogyi wg wzoru:

- jednostkach enzymatycznych U korzystając z zależności:

1 kat = 60·10⁶ U

2. Określ wpływ temperatury, jonów chlorkowych, cytrynianowych oraz alkoholu na aktywność amylazy.

Metody analizy oparte na pomiarze szybkości reakcji i wykorzystaniu jej wartości do oznaczenia stężenia substancji nazywane są kinetycznymi metodami analizy.

Metody kinetyczne stosowane są bardzo często w oznaczeniach śladowych ilości substancji, gdy wykazują one zdolności pełnienia roli katalizatora odpowiedniej reakcji wskaźnikowej. Można oznaczać w ten sposób np. jony metali przejściowych czy enzymy.

Szybkość takiej katalizowanej reakcji opisanej równaniem:



pierwszego rzędu względem substratu A można wyrazić równaniem:



gdzie: k₁ - stała szybkość reakcji,

a - początkowe stężenie substratu A,

x - stężenie produktu X po upływie czasu t,

(a - x) - stężenie substratu A po upływie czasu t,

c_k - stężenie katalizatora,

I_c - iloczyn lub bardziej złożona funkcja stężeń wszystkich pozostałych substancji biorących udział w reakcji.

Wartość I_c na ogół nie zmienia się podczas przebiegu reakcji i oznaczając jako k = k₁ · I_c otrzymujemy:



Oznaczenia kinetyczne można prowadzić w dwóch wariantach, różniczkowym i całkowym. W wariancie różniczkowym ograniczamy pomiary stężenia produktu X tylko do początkowego okresu reakcji, gdy x « a. Wzór (2) przybiera wtedy postać:



Całkując równanie (4) otrzymujemy liniową zależność stężenia produktu, które zwykle stanowi wielkość mierzoną od czasu:

x = k · a · c_k · t (5)

Należy pamiętać, że zależność (5) jest słuszna tylko dla początkowego przebiegu reakcji.

Jeżeli podczas pomiaru następują znaczne zmiany stężenia substancji A, wówczas stosujemy całkowy wariant metod kinetycznych całkując równanie (1). Otrzymujemy wówczas zależność:

_ (6)

która jest spełniona dla całego czasu przebiegu reakcji.

Oznaczenie stężenia katalizatora można przeprowadzić jedną z trzech metod stosując w każdej wariant różniczkowy lub całkowy.

1. Metoda tangensów.

a) wariant różniczkowy - bada się zmiany stężenia produktu (x) w czasie dla różnych stężeń katalizatora. Prowadząc pomiary w początkowym okresie przebiegu reakcji otrzymuje się zgodnie z zależnością (5) proste o różnych nachyleniach do osi czasu. Zmierzone tangensy kątów nachylenia (tg ) są liniową funkcją stężenia katalizatora, która stanowi prostą kalibracyjną.

b) wariant całkowy - nie ograniczający pomiarów stężenia produktu (x) do okresu początkowego przebiegu reakcji. Dla każdego badanego stężenia katalizatora sporządza się wykres zależności _. Zgodnie z zależnością (6) otrzymuje się także proste, których tangensy kąta nachylenia (tg ) są liniową funkcją stężenia katalizatora.

2. Metoda ustalonego czasu.

W metodzie tej mierzy się stężenie produktu (x) lub substratu po określonym czasie przebiegu reakcji dla różnych stężeń katalizatora.

a) wariant różniczkowy - prostą kalibracyjną stanowi zależność zmierzonego stężenia produktu od stężenia katalizatora.

b) wariant całkowy - prostą kalibracyjną stanowi zależność _ od stężenia katalizatora.

3. Metoda ustalonego stężenia.

W metodzie tej mierzy się czas reakcji (t) potrzebny do osiągnięcia założonego stężenia jednego z produktów lub substratów dla różnych stężeń katalizatora. Zarówno w wariancie różniczkowym jak i całkowym prostą kalibracyjną stanowi zależność odwrotności czasu reakcji od stężenia katalizatora

Celem ćwiczenia jest oznaczenie zawartości molibdenu(VI) kinetyczną metodą tangensów w oparciu o reakcję utleniania jonów jodkowych nadtlenkiem wodoru.

Utlenianie jonów jodkowych nadtlenkiem wodoru do wolnego jodu przebiega w środowisku kwaśnym zgodnie z równaniem reakcji:

2I^- H₂O₂ 2H  I₂ 2H₂O (7)

Wzrost stężenia jodu wydzielającego się w czasie trwania reakcji można śledzić spektrofotometrycznie. Mierzy się zmiany absorbancji barwnego kompleksu jod-skrobia, który wykazuje maksimum pochłaniania przy długości fali 560 nm.

Reakcja opisana równaniem (7) przy niskim stężeniu reagentów bardzo powoli. Śladowe ilości molibdenu(VI) wprowadzone do reagującej mieszaniny zwiększają, w sposób katalityczny jej szybkość. Wzrost szybkości reakcji jest proporcjonalny do stężenia molibdenu(VI), co pozwala na jego ilościowe oznaczenie.

Odczynniki

roztwór wzorcowy molibdenu (VI) o stężeniu c = 10 µg Mo/ml

roztwór nadtlenku wodoru o stężeniu c(NaOH) = 1 mol/l

roztwór jodku potasu o stężeniu c(KI) = 0.005 mol/l

roztwór kwasu siarkowego o stężeniu c(H₂SO₄) = 0.8 mol/l

roztwór skrobi o stężeniu c = 0.2%

Do kolbki miarowej o pojemności 25 ml wlać ok. 10 ml wody destylowanej, a następnie wprowadzić odmierzone dokładnie 2.5 ml roztworu wzorcowego molibdenu(VI) o stężeniu 10 µg Mo/ml. Uzupełnić kolbkę wodą destylowaną do kreski i dokładnie wymieszać.

Do kolbki miarowej o pojemności 25 ml wlać ok. 10 ml wody destylowanej, a następnie wprowadzić odmierzone dokładnie 2.5 ml roztworu nadtlenku wodoru o stężeniu 1 mol/l. Uzupełnić kolbkę wodą destylowaną do kreski i dokładnie wymieszać.