|
O‘zbekiston respublikasi oliy va o‘rta maxsus ta’lim vazirligi universiteti fakulteti
|
| bet | 9/11 | | Sana | 02.06.2023 | | Hajmi | 0.66 Mb. | | #68899 |
Bog'liq PZR TEXNOLOGIYA ZZZ Azizjon — копия, mb mustaqil ish Oygul, Ўралов Жавлонбек Кўчқорбой ўғли, 8 sinf kimyo fanidan taqvim rejalar 2022 2023 o\'quv yili, OarjhKqYURTNotk6cmQH1RWDK8u8cdRPqOguYugF, ARIZA voyaga yetmagan несовершеннолетн рус узб, 1683958228, genetik kod.ish1, Mustaqil talim genomika sheraliyev, noallel genlar I 3, TERMODINAMIK JARAYONLARNI TAVSIFLARI BILAN TANISHISH, Davomat, Termiz MTU ustavi, 3342204072 (2)6.5.1-rasm: DNK sintezi
PCR - bu in vitro yotgan DNK mintaqasini kuchaytirish texnikasi ma'lum ketma-ketlikning ikki mintaqasi o'rtasida.
PCR kuchaytirilishi oligonukleotid primerlari yordamida amalga oshiriladi. Bular odatda qisqa, bir zanjirli oligonukleotidlardir tashqi hududlarni to'ldiradi ma'lum ketma-ketlikda.
6.5.2-rasm: PCR kuchaytirilishi
Oligonukleotidlar vazifasini bajaradi primerlar DNK polimeraza uchun va ota-ona DNK dupleksining denatüratsiyalangan iplarining har biri vazifasini bajaradi. shablon.
Bu asosiy shablon iplarini to'ldiruvchi yangi DNK zanjirlarining sinteziga olib keladi.
Qadamlar:
Shablon denaturatsiyasi
Primerni yumshatish
Primer kengaytmasi
o'z ichiga oladi PCR kuchaytirish metodologiyasida bitta "tsikl".
Har bir tsikldan so'ng yangi sintez qilingan DNK zanjirlari mumkin shablon sifatida xizmat qiladi keyingi tsiklda (PZR primerlari odatda DNK shabloniga sezilarli molyar ortiqcha qo'shiladi)
Har bir PCR tsiklining oxirida mahsulotlarning qisqacha mazmuni:
6.5.3-rasm: PCR mahsulotlari
Istalgan PCR mahsuloti a bo'ladi belgilangan uzunlikdagi fragmentning dupleksi. Savol tug'iladi: qancha ishlab chiqariladi?
· Kutilgan kuchaytirish “x” shablonning asl konsentratsiyasiga nisbatan istalgan belgilangan uzunlikdagi mahsulotning quyidagi formula bilan ifodalanishi mumkin:
[(2n - (n + 1)) - (n + 1)] x
yoki
(2n - 2(n + 1))
(bu ko'pincha oddiy qoidaga qisqartiriladi kuchaytirish: (2n - 2n) x)
· Ushbu formulaning talqini shundan iboratki
Berilgan tsikllar soni uchun "n" biz "2" ni qilamizn x' umumiy mumkin bo'lgan duplekslar
Ma'lum miqdordagi tsikllar uchun "2(n+1) (bizning taxminiy hisobimizda 2n) x" duplekslar bo'ladi, ular asl shablondan yoki noaniq uzunlikdagi fragmentdan hamda belgilangan uzunlikdagi fragmentdan ( va kiruvchi mahsulotni ifodalaydi)
Shunday qilib, kerakli mahsulotning umumiy kontsentratsiyasi (PZR primerlari tomonidan belgilangan uzunlikdagi duplekslar) bo'ladi.
(2n - 2(n+1)) x (bu yerda x - dastlabki dupleks konsentratsiyasi)
Nazariy kuchaytirish qiymati amalda hech qachon erishilmaydi. Bunga bir qancha omillar to'sqinlik qiladi, jumladan:
1. Bir-birini to'ldiruvchi qiz iplarning qayta tiklanish uchun primerlar bilan raqobati (ya'ni, ikkita qiz ipning qayta tiklanishi kuchaytirilmaydi).
2. Termik denaturatsiya tufayli ferment faolligining yo'qolishi, ayniqsa keyingi davrlarda.
3. Termik denatürasyon bo'lmasa ham, keyingi sikllarda molar maqsadning oshib ketishi tufayli ferment miqdori cheklanadi (ya'ni 25-30 tsikldan keyin juda ko'p primerlar uzaytirilishi kerak)
4. Mumkin bo'lgan ikkinchi sayt primerini yumshatish va unumsiz astarlash
PCRning o'ziga xosligini oshirish polimerlardan emas, balki polimer bilan o'zgartirilgan GO'lardan kelib chiqishini tasdiqlash uchun biz yalang'och polimerlarning GO'siz PCR o'ziga xosligiga ta'sirini o'rganib chiqdik. GO hosilalarining TGA ma'lumotlariga ko'ra polimerlarning hisoblangan miqdori PCR tizimiga qo'shildi. Natijalar bandda hech qanday o'zgarish yo'qligini ko'rsatadi (S10-rasm). Polimer kontsentratsiyasi mililitr uchun mikrogramdan millilitrga milligramgacha ɭ,000 marta oshirilsa, PCRning o'ziga xosligini yaxshilash mumkin edi (S11-rasm). Ushbu natijalar PCRning o'ziga xosligini oshirish yalang'och polimerlardan emas, balki polimer bilan o'zgartirilgan GOdan kelib chiqishini ko'rsatadi. Oldingi natijalarga asoslanib, GO PCRning o'ziga xosligini yaxshi kuchaytiruvchi vosita emas. Shunday qilib, GO hosilasi bilan PCRning o'ziga xosligini oshirish GO va polimerlarning kombinatsiyasi yoki sinergik ta'siriga bog'liq.
5-rasmda GO yoki GO hosilalarining yuqori konsentratsiyasida boshqaruv chiziqlari (1-yo'lak) inhibe qilinganligini ko'rsatadi. Agar tekshirish uchun Pfu polimeraza GO va uning hosilalari yuzasiga adsorbsiya qilinmoqda, BSA ortiqcha GO va GO hosilalari tomonidan inhibe qilingan PCR tizimiga qo'shildi. BSA qo'shilgandan so'ng, barcha PCRlar tiklanadi va BSA kontsentratsiyasining ortishi bilan bandning intensivligi ortadi. Natija BSA ning GO va uning hosilalari yuzasida raqobatbardosh adsorbsiyasi bilan bog'liq. Shunday qilib, adsorbsiyalangan Pfu polimeraza eritmaga chiqarildi, natijada PCR qayta tiklandi. Natijalar shuni ko'rsatadiki, GO yoki GO lotinlari va o'rtasida kuchli o'zaro ta'sir mavjud Pfu polimeraza. Biz GO va uning hosilalarini ham inkubatsiya qildik Pfu polimeraza 1 soat davomida muzda etarli darajada so'rilishini ta'minlash uchun Pfu GO yoki uning hosilalari bilan polimeraza. Keyin biz boshqa PCR komponentlarini qo'shdik va PCRlarni o'tkazdik. S12-rasm adsorbsiyadan keyin samarali PCRni tasdiqlaydi Pfu GO yoki uning hosilalaridagi polimeraza.
GO o'lchamining PCRga ta'siri
Umumiy PCR jarayoni harorat o'zgarishining 25 tsiklini o'z ichiga oladi. Oddiy PCR sikli quyidagi uch bosqichdan iborat: 1) shablon DNKning denaturatsiyasi, 2) ikkita sintetik primerning DNK shabloniga tavlanishi va 3) termostabil DNK polimeraza bilan katalizlangan bog'langan primerlarning kengayishi. 5 PCR maqsadli genni eksponent tarzda ko'paytirishi mumkin bo'lsa-da, o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirish muammo bo'lib qolmoqda. Ayniqsa, ko'p davrali PCRda, reaksiyaga kirishmagan dastlabki DNK shablonlari va primerlar reaktsiyani buzadi va o'ziga xos bo'lmagan mahsulotlarning to'planishiga olib keladi. 43 Dastlabki tadqiqotlarda biz PCR kuchaytirilishining shablonini sifatida pET-32a plazmididan foydalandik. Shablonning optimal konsentratsiyasi ketma-ket suyultirish tajribalari bilan aniqlandi (S8-rasm). Jami 0,5 ng μL plazmid birinchi davradagi PCRda optimal shablon kontsentratsiyasi sifatida qabul qilindi va birinchi davra PCR mahsulotining 0,5 μL ikkinchi davradagi PCRda optimal shablon konsentratsiyasi hisoblanadi. Turli o'lchamdagi (S-GO va L-GO) GO ning PCRning ikki bosqichiga ta'siri o'rganildi. Birinchi davra PCRda 689 bp maqsadli bandning intensivligi GO konsentratsiyasining oshishi bilan kamayadi, bu reaktsiya yuqori konsentratsiyada S-GO va L-GO tomonidan inhibe qilinganligini ko'rsatadi (4,8 μ g ml ). S-GO va L-GO uchun 6,4 μg ml -rasm 2A–C). Ikkinchi tur PCRda shablon sifatida birinchi davra PCR mahsuloti ishlatilgan.PCR mahsuloti nafaqat maqsadli mahsulotni, balki reaksiyaga kirishmagan dastlabki DNK shablonini, primerlarni va o'ziga xos bo'lmagan mahsulotlarni ham o'z ichiga olganligi sababli, bu moddalar ikkinchi davra PCR jarayonini buzadi va o'ziga xos bo'lmagan mahsulotlarning to'planishiga olib keladi, bu esa GOsiz aniq surtma chiziqlariga olib keladi (2D-rasm). va E). Biroq, S-GO yoki L-GO qo'shilgandan so'ng, smear bantlari yo'qoldi. S-GO va L-GO konsentratsiyasining oshishi bilan nonspesifik mahsulotlar kamaydi. L-GO S-GO ga qaraganda yaxshiroq ta'sir ko'rsatdi, chunki u PCR ning o'ziga xosligini oshirish uchun kengroq samarali kontsentratsiya diapazoniga ega edi (S-GO uchun 1,6 ,2 μg ml 0,8,8 μg ga nisbatan L-GO mL L-GO ).
2.3.PZR ning kasalliklar diagnostikasidagi ahamiyati
Oxirgi marta men E. Coli hujayralarida yangi genni ifodalagan laboratoriyani o'tkazganimda, o'rta maktabda biotexnologiya darsi edi, garchi sozlashning katta qismi biz uchun qilingan. Eslayman, bizning birinchi qadamimiz PCR yordamida kerakli DNK fragmentini kuchaytirish edi, lekin men bilmayman, fragment dastlab qanday qilib izolyatsiya qilingan. Men bilamanki, primerlar DNK klonlanishining boshlang'ich va oxirgi pozitsiyalarini belgilash orqali yordam beradi, lekin agar siz kerakli genni o'z ichiga olgan butun xromosomadan foydalansangiz, unda primerlar qo'shilishi mumkin bo'lgan ko'plab saytlar bo'lishi mumkin. kerakli hudud. Agar men xohlagan oqsil uchun DNK ketma -ketligi allaqachon ma'lum bo'lsa, men xohlagan genni o'z ichiga olgan bo'lakni qanday olishim mumkin?
Bundan tashqari, bu jarayon qanchalik qiyin bo'ladi? Oxirgi maqsad aslida oqsilni o'rganish bo'lgani uchun, men bu qadam o'z -o'zidan to'liq tezisga aylanishini xohlamayman. Ba'zi o'ziga xos oqsillar uchun jarayon yaxshi hujjatlashtirilgan ko'rinadi va nisbatan keng tarqalgan materiallar yordamida va oddiy ko'rsatmalarga rioya qilish orqali amalga oshirilishi mumkin, ammo ilgari maxsus bajarilmagan gen bilan urinish uchun protsedura qanchalik farqlanishini kutishim kerak?
O'ziga xoslikni ta'minlash uchun primer ketma-ketligini genomga solishtiradigan yoki ma'lum bir hududni kuchaytirish uchun maxsus primerlarni loyihalashga yordam beradigan bir qator primer sinov vositalari mavjud. Boshlash uchun bir joy - NCBI Primer BLAST; bog'langan sahifada ma'lum bir genni kuchaytirish uchun primerlarni yaratish uchun undan qanday foydalanish kerakligi tushuntiriladi.
Genomik DNKda PCR qilish biroz qiyin bo'lishi mumkin, chunki siz tozalash jarayonidan o'tadigan DNKga kirish, ifloslanish va PCR inhibitörleri kabi ko'plab chalkash omillar bilan kurashishingiz kerak. Bundan tashqari, genlar ko'pincha katta intronlarni o'z ichiga oladi, shuning uchun siz PCRni o'ta uzoq shablonda (genning o'lchamiga qarab juda qiyin yoki hatto imkonsiz) bajarasiz va oxir-oqibat siz butun intronlar bilan yakunlanasiz. intronli genlar ketma -ketligi, buni transgen sifatida ifodalash uchun sizga kerak emas.
Buning o'rniga men sizni qiziqtirgan geningizning cDNK klonini sotib olishni va undan ko'paytirishni tavsiya qilaman. cDNK birlashtirilgan mRNK ketma-ketligidan yaratilgan, shuning uchun u ancha boshqarilishi mumkin bo'lgan uzunlik bo'ladi va muqobil birlashma bilan bog'liq muammolarni oldini oladi.
Agar siz gen uchun NCBI sahifasiga kirsangiz, "Tegishli ma'lumotlar" ostidagi o'ng panelda cDNA kloniga buyurtma berish havolasini ko'rasiz. Bu sizga $ 60 - $ 90 atrofida shu genni o'z ichiga olgan tozalangan plazmid sotib olishning bir necha variantini beradi. Ushbu plazmid bilan ishlash genomik DNKga qaraganda ancha oson bo'ladi va bu sizga vaqt va pulni tejaydi, ayniqsa molekulyar klonlashda hali tajribasiz bo'lsangiz.
Albatta, bu endi 2003 yil emas va molekulyar klonlash bilan shug'ullanish g'oyasi vaqt va pulni behuda sarflash degan yaxshi dalil bor. Agar sizning byudjetingiz bunga ruxsat bersa, eng oson va tezkor usul - bu sizning kompaniyangizga geningizni sintez qilish uchun to'lash. Misol uchun, Genewiz 0,28 $/s ga snythesis taklif qiladi, lekin siz xarid qilsangiz, yaxshiroq shartnoma olishingiz mumkin.
Sintezning afzalligi shundaki, siz birinchi marta mukammal bajarilgan aynan to'g'ri vektorga klonlangan aniq ketma-ketlikni olishingiz mumkin. Agar sizda bu borada tajribangiz bo‘lmasa, genni o‘zingiz klonlashga urinish siz o‘ylagandan ko‘ra ko‘proq vaqt talab etadi va ko‘proq pul talab qiladi. Haqiqiy tajribangizga o'tish uchun uni sintez qilish yaxshiroqdir.
RNK polimeraza zanjirli reaktsiyasi - bu RNK shablonidan boshlab kuchaytirishga imkon beradigan PCR texnikasining modifikatsiyasi. So'nggi paytlarda polimeraza zanjir reaktsiyasi sohasida olib borilgan izlanishlar usulning samaradorligiga hissa qo'shadigan texnikaning rivojlanishiga olib keldi. PCR - bu ko'p qirrali usul. PCRning muhim o'zgarishlari quyidagilar:
Teskari PCR: PCR, primer bilan o'ralgan emas, balki primerdan uzoqda joylashgan DNK ketma -ketligini ko'paytirish uchun ishlatilishi mumkin. Kuchaytiriladigan ketma -ketliklar vektorda klonlanishi mumkin va vektorning chegara ketma -ketligi astar sifatida ishlatilishi mumkin, shunda polimerizatsiya teskari yo'nalishda davom etadi.
Ankorlangan PCR: Bu usulda faqat bitta astar ishlatiladi. Avval bitta ip ko'chiriladi, so'ngra yangi sintez qilingan ipning oxirida poli G dumi biriktiriladi. Bu PCR tomonidan ishlab chiqarilgan DNKning bitta zanjirlarini nusxalash uchun primer sifatida qo'shimcha homopolimer-poli-C dan foydalanishga imkon beradi. Bu normal kuchaytirilishi mumkin bo'lgan to'liq DNK dupleksini keltirib chiqaradi.
RT-PCR: Teskari transkripsiya vositasida PCR CDNA sintezi (teskari transkripsiya orqali) va PCRni kuchaytirish jarayonini birlashtirgan bitta dasturni o'z ichiga oladi. U, shuningdek, teskari transkriptaza fermenti yordamida mRNKdan sintezlangan, ikki qatorli CDNAga ham qo'llanilishi mumkin. Termostabil ferment rTth cDNA sintezidan RNK shablonlarini ishlatadi va shu tariqa qushlar murini virusidan (AMV RTase) bitta fermentli RT-PCR virusli teskari transkriptazaga ruxsat beradi.
|
| |
