• Real-Time PCR
    		•

    PZR usulining kamchiliklari




    Download 0,49 Mb.
    bet5/6
    Sana17.12.2023
    Hajmi0,49 Mb.
    #121581
    1   2   3   4   5   6
    Bog'liq
    PCR

    PZR usulining kamchiliklari

    • 1. Tirik mikroorganizmlarning ham, o'lik mikroorganizmlarning DNKsi amplifikatsiyalanadi.Bu davolash samaradorligini nazorat qilish uchun PCRdan foydalanganda ma'lum talablarni qo'yadi. Umuman olganda, bunday nazorat patogen butunlay yo'q qilingan vaqtdan keyin amalga oshirilishi kerak. Biroq, NASBA usuli RNKni faqat tirik mikroorganizmlardan aniqlaydi va bu cheklovlardan qochadi.
    • 2. Yuqori sezuvchanlik. Bir qator mikroorganizmlar (shartli patogen flora, UPF) odatda odamlarda oz miqdorda bo'lishi mumkin. PCR usuli yordamida, hatto patologiya bo'lmasa ham, UPFning eng kichik miqdori aniqlanadi. Biroq, bu muammo DNK miqdorini aniqlash usuli (Real-time PCR) paydo bo'lishi bilan hal qilindi.
    • 3. Turli test tizimlaridan foydalanishdagi farqlar. Yuqorida aytib o'tilganidek, patogen genomning turli qismlarini kuchaytirish uchun foydalanish mumkin. Biroq, mikroorganizmlarning turli mutatsiyalari bo'lsa, genlarning o'zgarishi yoki yo'qolishi mumkin. Bu turli ishlab chiqaruvchilarning test tizimlaridan foydalanganda turli natijalarga olib keladi.

    Real-Time PCR

    • Real-Time PCR usulining prinsipi reaksiya jarayonida allaqachon kuchaytiruvchi mahsulotlarni aniqlash va amplikat to'planishi kinetikasini kuzatishga asoslangan. Bu shuni anglatadiki, PCR natijasi (amplikatlar soni) an'anaviy PCR kabi oxirida emas, balki har bir amplifikatsiya siklidan keyin hisobga olinadi. Dastlabki namunada qanchalik aniq DNK bo'lsa, aniq bo'laklar soni shunchalik tez va ko'p bo'ladi."Real-Time PCR" o'rganilayotgan materialdagi DNK tarkibini miqdoriy baholash imkonini beradi.

    1. 5' so'nggi tegning bo'linishi (TaqMan tahlili).Bu usul polimerazaning 5'-eksonukleaza faolligidan foydalanishga asoslangan. Reaksiya aralashmasiga DNK problari qo'shiladi, ular 5' holatida lyuminestsent yorug’ligi va 3' holatida flüoressant gasitel, shuningdek, 3' holatida fosfat guruhini o'z ichiga oladi.

    • Ushbu zondlar amplifikatsiyasi kerak bo'lgan bo’laklarda o’rnashish joylariga ega. Gasitel floresan yorlig'i chiqaradigan nurlanishni o'zlashtiradi va 3' holatidagi fosfat guruhi polimerazani bloklaydi. PCR paytida, primerni yumshatish bosqichida, DNK namunasi komplementar DNK zanjiriga biriktiriladi va PCR paytida qancha ko’p amplifikatsiya mahsulotlari hosil bo'lsa, mos keladigan amplikonlarga ko'proq namuna molekulalari bog'lanadi. Cho'zilish bosqichida polimeraza komplementar DNK zanjirini sintez qiladi va zondga etib borgach, 5' ekzonukleaza faolligi mavjudligi sababli uni parchalashni boshlaydi. Shu tarzda, lyuminestsent yorug’ligi va gasitel ajratiladi, bu esa aniqlangan yorug’lanishning oshishiga olib keladi. Shubhasiz, ma'lum bir vaqtda PCR paytida qancha ko'p amplikonlar hosil bo'lsa, yorug’lanish shunchalik kuchli bo'ladi.

    Amplifikatsiya mahsulotlarining deteksiyasi

    Download 0,49 Mb.
    1   2   3   4   5   6




    Download 0,49 Mb.