|
Vektor molekulalar. Klonlash uchun vektorlar. Ekspression vektorlar
|
| bet | 1/4 | | Sana | 24.02.2024 | | Hajmi | 27.52 Kb. | | #162052 |
Bog'liq 8-mavzu 2-maruza, 1710913146
Transgen o’simliklar olishda qo’llaniladigan asosiy vektor konstruksiyalar.
REJA:
Vektor molekulalar.
Klonlash uchun vektorlar.
Ekspression vektorlar.
Transformatsiya uchun vektorlar.
Rekombinant DNK konstruksiyasini yaratish. Turli biologik manbalardan ajratilgan ikki yoki undan ko‘p DNK fragmentlarining birikishidan hosil bo‘lgan DNK molekulasi rekombinant DNK deyiladi. DNKning muayyan fragmentlari, shuningdek, zarur genni tutuvchi fragmentlari restriktazalar yordamida olinadi. Restriktazalar «to'mtoq» uchli va «yopishqoq» uchli fragmentlar hosil qiladi. DNK fragmentlarini bitta molekulaga birlashtirish bu fragmentlarning qanday uchga ega ekanligiga bog’liq holda, turli usullar yordamida amalga oshiriladi.
Bir xil izchillikka cga «yopishqoq» uchli fragmentlarni birlashtirish usuli. Ba’zi restriktazalar, masalan EcoRl, DNK zanjirida tanib kesadigan sayt markazidan bir xil masofada zina hosil qilib, simmetrik uzish paydo qiladi. Bu bir-biriga komplementar uchastkalar asosining juftlashishi hisobiga yoki «yopishqoq» uchlari orqali birlashish tendensiyasiga ega bo'ladi.
Asoslarning juftlashishi faqatgina komplementar izchilliklar o'rtasida sodir bo’ladi, shuning uchun EcoRl ta’sirida paydo bo‘lgan AATT-uchlar, masalan, Hind III tomonidan hosil qilingan AGCT-uchlar bilan qovushmaydi. Lekin bir restriktaza ta’sirida hosil qilingan har qanday DNK bo'laklari (kelib chiqishidan qat’i nazar) komplementar nukleo24 tidlarning bir zanjirli uchastkalari orasida vodorod bog1 lari hosil qilish hisobiga birikishi mumkin.
Lekin bunday juftlashishdan so‘ng ham DNK qo‘sh zanjirining butunligi to‘lig‘icha tiklanmaydi va fosfodiefir bog‘ida ikkita uzilish qoladi. Ulami tiklash, ya’ni tikish yoki ligirlash uchun DNK ligazadan foydalaniladi. Rekombinant molekulalar hosil qilish ishlarini ligaza fermenti yakunlaydi. Bunday tajribalar birinchi marta 1972-yilda (P.Berg, AQSH) bajarilgan va «yopishqoq» uchlar hosil qiluvchi restriktazalar bilan DNK ligazadan birgalikda foydalanish rekombinant DNK molekulasi olishning umumiy usullarini yaratishda asos bo‘lib xizmat qilishi ko'rsatilgan. Shu laboratoriyada birinchi marta SV40 virusi va E. colining galaktoza operonini tutuvchi X bakteriyafagi rekombinant DNK siga biriktirilgan.
«To‘mtoq» uchli fragmentlarni birlashtirish usuli. Restriksiya sayti ichida to‘g‘ri uzish hosil qiluvchi restriktazalar ta’sirida «to‘mtoq» uchli DNK fragmentlari paydo bo‘ladi, ulami ham DNK-ligaza fermenti yordamida biriktirish mumkin. Bunday hollarda ligirlash reaksiyasi o‘ziga xos bo‘lib, uning samara darajasi «yopishqoq» uchlarni biriktirishga nisbatan bir oz pastroq. Ammo «to'mtoq» uchli fragmentlar biriktirishining «yopishqoq» uchli fragmentlarini biriktirishga nisbatan afzalligi shundaki, «to‘mtoq» uchli bu fragmentlar qaysi restriktaza ta’sirida paydo bo‘lishidan qat’i nazar, turli restriktazalar tomonidan hosil bo‘lgan fragmentlarda oson birikadi.
«Yopishqoq» va «to‘mtoq» uchli DNK fragmentlarni biriktirish usuli. DNKning «yopishqoq» uchli fragmentlarini fermentativ yo‘l bilan «to‘mtoq» uchli DNK molekulasiga biriktirish mumkin. Buning uchun «yopishqoq» uchlar «to‘mtoq» uchlarga aylantiriladi, ya’ni DNKning faqat bir zanjirli uchastkalarini gidrolizlovchi SI nukleaza fermenti yordamida «yopishqoq» uchlardagi nukleotidlar kesiladi yoki DNK polimeraza I yordamida bir zanjirli «yopishqoq» uchlaridan ikkinchi zanjir sintezlanadi, ya’ni qo‘shimcha nukleotidlar qo‘shiladi. Shunday usulda «yopishqoq» uchli DNK fragmentlaridan «to’mtoq» uchli fragmentlar hosil qilinadi va u boshqa «to‘mtoq» uchli DNK fragmentlariga DNK ligaza fermenti yordamida biriktiriladi. DNK fragmentlari probirkada birlashtirilganidan so‘ng, ulami tirik hujayralarga kiritish kerak. Buning uchun maxsus vektor molekulalardan foy-dalaniladi.
|
| |
