12-MA’RUZA:RESTRIKSIYA VA RESTRIKTAZALAR
Reja:
1.Restriksiya jarayoni
2.Restriktaza fermentlari
3.Restriktazalarning biokimyoviy ta’sir etish mexanizmi
Bakteriyalar o‘rtasida DNK almashinishi keng tarqaganligi, ushbu bakteriyalar oldiga o‘z genomini saqlash vazifasiniyuklaydi. Har doimo hujayra ichiga kirgan begona DNK foydali bo‘lavermaydi. Bundan tashqari, begona genetik material hujayraga zarar yetkazishi mumkin, ayniqsa u bakterial virus yoki bakteriofagga tegishli bo‘lsa. Begona DNK bilan kurashish maqsadida bakteriyalar o‘z DNKlarini ajrata bilishlari kerak. Bunga maxsus modifitsirlovchi ferment yordamida o ‘z DNK larini “nishonlash” yo‘li bilan erishiladi. Deyarli barcha turdagi bakteriyalarda adenin yoki sitozinni ma’lum, faqatgina mazkur turga xos bo'lgan ketma-ketlikni modifitsirlovchi metilazalar mavjud. Bakteriyalardagi boshqa maxsus ferment - restriksiya endonukleazalari (restriktazalar) ana shu ketma-ketlikni parchalaydilar (kesadilar). Shu yo‘l bilan bakteriyalar ularga begona
genetik material o‘tish imkoniyatini chegaralaydilar. Molekulyar klonirlashda donor va vektor DNKlarning parchalanishi maxsus uchastkalarda (saytlarda) o‘tishi kerak, natijada ma’lum fragmentlar yig‘indisi hosil bo'lishi lozim. Agar xromosoma DNKsini, ninasi kichik diametrli shpritsdan o‘tkazilsa yoki ana shu
DNKga ultratovush bilan ishlov berilsa, natijada 0,3 - 5m.j.n. fragmentlari hosil bo'ladi. Afsuski, ana shu oddiy muolajalar natijasida ikki zanjirli DNK molekulasi tasodifiy yo‘l bilan parchalanadi va har bir ishlov berilgandan so‘ng, butunlay yangi DNK fragmentlarining yig‘indisi hosil bo‘ladi. Ikki zanjirli DNK molekulasidagi asoslarning maxsus ketma-ketliklarni tanib, o‘sha yerdan ikkala zanjiri kesadigan yuqori spetsifik restriktazalarni ajratib olinishi yo‘lga qo‘yilgandan keyingina molekulyar klonirlashni o‘tkazish imkoniyati yaratildi.
Eng birinchi restriktazalar Esherichia coli bakteriyasidan ajratib olinib, unga EcoRll deb norn berildi. Bu ferment DNK molekulasidagi olti juft asoslar palindrom ketma-ketligini tanib, har bir zanjirning adenin va guanin oralaridagi bog‘ni uzadi. Hozirgi vaqtda EcoRll dan boshqa bakterial hujayralardan yuzlab 11- tipdagi restriktazalar ajratib olindi va ular genlarni klonirlashda muhim ahamiyatga egadirlar. DNKni ma’lum restriktaza yordamida parchalash natijasida har doim bir xil DNK fragmentlarining yig‘ indisi hosil bo‘ladi. Agarda restriktsiyaning bir nechta fermentlaridan foydalanilsa va avval har bir restriktaza bilan alohida, keyin esa ularning kombinatsiyalari bilan DNKga ishlov berilsa, mazkur DNKning kartasini tuzish, ya’ni DNK molekulasidagi restriktsiya saytlari ketma-ketlik tartibini aniqlash mumkin. Olingan fragmentlarining gel-elektroforez yordamida
o‘lchamini aniqlab, restriktsion saytlarni joylashishini aniqlash ham mumkin. Plazmidalar. Molekulyar klonirlashda restriktazalardan tashqari, vektor molekulalari ham ishtirok etadilar, asosan bu vazifani plazmidalar bajaradi. Transformatsiya va ajratish. Endi rekombinant DNKni xo'jayin hujayrasiga kiritish kerak. Erkin DNKni bakterial hujayraga kirgizish jarayonini transformatsiya deb ataladi. Xo‘jayin-hujayra sifatida E.coli ko'pgina rekombinant DNKlar bilan ishlashda qo’llanadi. Plazmida DNKsi E.coli ichiga kirishini ta’minlash uchun ularga yaxlit CaCh eritmasi bilan ishlov beriladi va keyin 42°C 1,5 minut saqlaydilar. Bunday muolaja natijasida hujayra devorining lokal buzilishi sodir bo'ladi. Mazkur usul yordamida transformatsiya maksimal darajada o‘tadi, chastotasi 10 teng (har bir 1000 hujayradan 1 tasi transformirlangan bo’ladi). Transformatsiya chastotasi hech qachon 100% teng bo‘lmaydi, ammo bu kamchilik transformatsiyaga uchragan hujayralarni tez ajratadigan uslublarni qo‘llanishi bilan to’ldiriladi. Transformatsiya jarayoni tugagandan keyin, rekombinant DNK tutadigan hujayralarni ajratib olish-identifikatsiyalash jarayoni boshlanadi. Identifikatsiya uslublari imkoni boricha soddaroq bo'lishi kerak, chunki juda ko‘p miqdordagi hujayralar tekshiruvdan o'tishi kerak. Tirik hujayra organioidlarini muayyan usullar orqali maqsadga muvofiq kerakli mahsulotlarni sintezlashga qairatishni biologic ahamiyati benihoya kattadir. Hozirgi kunda hayvon va o‘simlikhujayralarini maxsus oziqa muhitiga o'tkazib, ilmiy model sifatidafundamental tadqiqot ishlari olib borilmoqda. Biologiya fanida hujayraasosidagi tadqiqot ishlarini olib borish, hujayra muhandisligi yoki injenerligi deb nomlanib, mazkur soha biologiya fanining dolzarb zamonaviy yo‘nalishi hisoblanadi.
|
