|
Bakteriya plazmidalaridan klonlashda foydalanish
|
| bet | 4/4 | | Sana | 24.02.2024 | | Hajmi | 27.52 Kb. | | #162052 |
Bog'liq 8-mavzu 2-maruza, 1710913146Bakteriya plazmidalaridan klonlashda foydalanish. Bakteriya hujayrasida xromosoma DNK sidan tashqari, ko‘p nusxada halqasimon DNK molekulalari ham mavjud. Bunday halqasimon molekulalar plazmidalar deb ataladi. Ba’zi plazmidalar tarkibida antibiotikka chidamlilik genlarini tutadi. Hujayrada plazmidalaming ko‘p nusxada hosil bo’lishi natijasida antibiotiklami biokimyoviy neytrallovchi fermentlarning sintezi tezlashadi va hujayraning antibiotikka chidamliligi ortadi. Yuqorida bayon etilganidek, kalsiy ionlari ishtirokida tarkibida plazmidasi yo‘q bakteriyalar tomonidan plazmidalar oson yutiladi. Bakteriyalar hujayrasida faqat bir tipdagi plazmidalar ishtirok etishi mumkin. Hujayradagi plazmidalar nusxasining soni o‘zgarib turadi. Bu hujayraning va plazmidalaming irsiy xususiyatlariga bog‘liq. Ba’zi turdagi plazmidalar hujayradagi soni 10-200 nusxa bo’lguniga qadar ko‘payishni davom ettiradi. Boshqa turlari esa bakteriya xromosomasining ko‘payish tezligida replikatsiyalanadi. Bunday tipdagi plazmidalar hujayrada bir dona yoki bir nechta boMishi mumkin. Klonlash uchun faqat birinchi tipdagi plazmidalar asosidagi vektorlardan foydalanish maqsadga muvofiqdir.
Plazmidalardan vektor sifatida birinchi marta 1973-yilda P.Berg laboratoriyasida foydalanilgan. Tajribalar uncha katta bo’lmagan, tetratsiklinga chidamlilik geni tutuvchi E.coli plazmidasi pUC 101 da olib borilgan. Plazmida tarkibida faqat bir dona EcoRI restriktaza fermenti tanib kesadigan sayt (maxsus nukleotidlar izchilligi) bo’lganligi sababli, ferment plazmidaning halqasimon qo‘sh zanjirini faqat bir joyidan kesib «yopishqoq» uchli ochiq halqa holatiga o‘tkazadi. Plazmida pUC 101 ning DNK si ichak tayoqchasi uchun begona DNKning E.coR1-fragmentlari bilan aralashtiriladi. DNK-ligaza fermentlari yordamida begona DNK fragmentlari va pUC101 plazmida yagona rekombinant molekulaga birlashtiriladi. So‘ngra bu rekombinant plazmidani E.coli ning kompitent hujayralariga qo'shilganda u bakteriya hujayrasiga kiradi. Rekombinant plazmidani tutuvchi hujayralar tetratsiklinli selektiv muhitda ajratiladi.
Bu tarixiy tajriba gen muhandisligi ishlarining boshlanishiga asos bo‘ldi. Prokariot va eukariot hujayralariga turli DNK fragmentlarni kiritish va yangi xususiyatli hujayralar olish bo‘yicha tajribalar o‘tkazish imkoniyati yaratildi.
Hozirgi vaqtda tabiiy vektorlar asosida foydalanish qulay bo‘lgan vektor konstruksiyalari yaratilgan. Ulardan pUC tipi vektorlari va ularning hosilalari (pBluescript, pGEM) keng tarqalgan bo‘lib, ulardan klonlash uchun ham, shuningdek, ekspressiyalash uchun ham foydalanish mumkin. Uncha katta bo’lmagan pUC vektorlari tarkibida replikatsiya boshlanish nuqtasi izchilligini tutib, bu ularga bakteriya hujayrasida mustaqil replikatsiyalanish imkonini beradi. pUC vektorida klonlashni osonlashtirish uchun ko‘p foydalaniladigan restriktazlarda takrorlanmas restriksiya saytlarini aks ettiruvchi sun’iy sintezlangan polilinker izchilligi mavjud.
Polilinker vektordagi begona gen ishtirokining qulay markeri hisoblangan lac Z geniga o‘rnatilgan. lac Z geni X-gel substratni parchalash xususiyatiga ega (3-galaktozidaza hosilalari) (3-galaktozidaza genini kodlaydi. Bunda bakteriya hujayralari rangi oq rangdan moviy ranggacha o‘zgaradi. Polilinkeming unclia katta bo'lmagan izchilligi (100-20 n.j.) (3-galaktozidaza oqsili sinteziga ta’sir etmaydi. Begona DNK fragmentini klonlash uchun lac Z geni ekspressiyasini nobud qiluvchi pf/C-vektori polilinkeriga biriktiriladi. DNK ulangan vektor tutuvchi hujayralar X-gal substratni parchalaydi va bunday bakteriya hujayralari boshqa gen ulanmagan bo‘sh plazmida vektori tutuvchi moviy rang hujayralardan farqli oq rangda qoladi. pUC vektorlar va uiaming hosilalarining oq-moviy rang seleksiyasi klonlash jarayonini ancha osonlashtiradi, chunki vektor plazmidaga begona genlami ulash juda kam hollarda muvaffaqiyatli chiqadi. Aksariyat hollarda 10-30 ta ligirlangan molekulalardan faqat bittasi rekombinant bo‘ladi, ya’ni o'zining tarkibida begona fragment tutadi va faqat moviy rang seleksiya yordamidagina rekombinant DNK tutuvchi bakteriya klonlarini aniqlash mumkin. pUC vektorlar tarkibida kionlangan genlarning transkripsiyasini ta’minlovchi regulator izchillikdan iborat maxsus ekspression kassetalar tutadi.
|
| |
