Aminokislotalar oqsil sintezi paytida hosil qilinmaydi. Baʼzi talabalar oqsil sintezidan asosiy maqsad aminokislotar hosil qilish deb oʻylashadi. Lekin translyatsiya paytida aminokislotalar yaratilmaydi, balki oqsil hosil qilish uchun ular qurilish materiali sifatida ishlatiladi.
Mutatsiyalar har doim ham keskin yoki salbiy taʼsirga olib kelmaydi. Odatda odamlar “mutatsiya” atamasini ommaviy axborot vositalaridan eshitib, bunday odam kasal yoki majruh deb tushunadi. Mutatsiyalar genetik xilmaxillik manbai boʻlib, ularning baʼzilari zararli boʻlishiga qaramasdan, aksariyati ahamiyatsiz, koʻpchiligi hatto yaxshi hisoblanadi.
Uchta nukleotidga karrali boʻlgan insersiyalar va deletsiyalar oʻqish doirasini siljituvchi mutatsiyalarga sabab boʻlmaydi. Aksincha, bir yoki bir nechta aminokislotalar oqsilga qoʻshiladi yoki oqsildan tushib qoladi. Lekin uchta nukleotidga karrali boʻlmagan insersiyalar va deletsiyalar oqsildagi aminokislota ketma-ketligini keskin oʻzgartirib yuboradi.
Kimyoviy sekvens nukleotidlarning tanlab kimyoviy degradatsiya qilinishiga asoslangan. U 1977-yilda A.M. Maksam va V. Gilbert tomonidan taklif etilgan va ularning nomi bilan ataladi. Bu usulda sekvenirlashda DNK ning bir zanjirli molekulasini olish zarur, uning bir uchini 32P izotopi bilan nishonlanadi, nishonlangan DNK preparati to‘rt bo‘lakka bo’inadi va har biriga to‘rt asosni bir yoki ikkiga bo‘luvchi maxsus reagent bilan ishlov beriladi. Masalan, 60%-li chumoli kislotasini qo'shish purin asoslari (A+G) ni, dimetilsulfat faqat guanin asoslarini; toza gidrazin esa pirimidin asoslari (T+C) ni parchalaydi, 1,5 normalli Nacl eritmasida esa faqat sitozinli asoslar parchalanadi.
Natijada nishonlangan bo‘laklar to‘plami olinib, ularning uzunligi shikastlangan asosdan to molekulaning oxirigacha bo‘lgan masofada aniqlanadi. To‘rttala reaksiya natijasida hosil bo’lgan bo‘laklarni denaturatsiyalovchi sharoitda akrilamid gelida to‘rtta qo‘shni yo'lakchalarga quyib chiqiladi. Shundan so‘ng radioavtografiya amalga oshiriladi, natijada radioaktiv nishonga ega bo‘laklar rentgen plyonkasida iz qoldiradi. Ularning joylashuviga ko‘ra, nishonlangan qismdan shikastlangan asos qanday masofada joylashganini, buni o‘rganish orqali ularning holatini aniqlash mumkin. Rentgen plyonkasidagi chiziqlar yig‘indisiga ko‘ra, tahlil qilinadigan DNK bo‘lagining nukleotid ketma-ketligi aniqlanadi.
Ushbu usul yordamida qisqa muddat ichida SV40 virusi, pBR322 plazmidasi va boshqa ko‘plab organizmlar DNK ketma-ketliklarini to‘liq aniqlashga muvaffaq bo'lingan. Biroq Maksam-Gilbert usuli muolajalarining sezilarli darajada qiyinligi va uzoq davom etishi bilan bog‘liq bir qator kamchiliklarga ega. Hozirgi vaqtda kimyoviy degradatsiya yordamida sekvenirlash asosida nukleotid ketma-ketliklarini tez va mukammal aniqlash usullari ishlab chiqilgan bo‘lib, qattiq fazali sekvenirlash va aylanma fazali xromotografiyadan foydalanish orqali ham sekvenirlash amalga oshiriladi.
Fermentativ sekvenirlash Senger tomonidan 1977-yilda taklif etilgan nukleotidi zanjirni terminatsiyasi (sintezni to‘xtatib qo‘yish) yo‘li bilan sekvenirlash usuli keng qo‘llaniladi. Senger usuli negizida (komplementar) DNK zanjirining replikatsiyasi tamoyili yotadi. U DNK ketma-ketligi sintezi uzilgan, ya’ni zanjir o‘sishi terminatsiyaga uchragan turli qismlarida amalga oshadi. Fermentativ sekvenirlashning asosiy xossasi tuzilayotgan zanjir sintezining terminatsiyasiga asoslanadi.
Replikasiyani to‘xtatishga sabab bo‘ladigan terminatsiya agentlari 2', —3'-didezoksitrifosfatlar (ddATP, ddGTP, ddTTP, ddCTP) hisoblanadi. Mazkur modifikatsiya qilingan azotli asoslar keyingi dezoksiri bonukleotid bilan fosfodiefir bog‘larni hosil qila olmaydi.
4-ma’ruza: Rekombinant DNK olish
Reja
1. Kodlovchi DNK olish.
2. Kerakli klonlarni ajratishda qo‘llaniladigan usullar.
3.Nukleotidlar ketma-ketligini aniqlash usullari
Turli biologik manbalardan ajratilgan ikki yoki undan ko‘p DNK fragmentlarining birikishidan hosil bo‘lgan DNK molekulasi rekombinant DNK deyiladi. DNKning muayyan fragmentlari, shuningdek, zarur genni tutuvchi fragmentlari restriktazalar yordamida olinadi. Restriktazalar «to‘mtoq» uchli va «yopishqoq» uchli fragmentlar hosil qiladi. DNK fragmentlarini bitta molekulaga birlashtirish bu fragmentlarning qanday uchga ega ekanligiga bog'liq holda, turli usullar yordamida amalga oshiriladi.
Restriktaza ligaza metodi
Qo'shimcha "yopishqoq" uchlari bo'lgan gen va vektor uchun qo'llaniladi
Bir xil izchillikka ega «yopishqoq» uchli fragmentlarni birlashtirish usuli. Ba’zi restriktazalar, masalan EcoRI, DNK zanjirida tanib kesadigan sayt markazidan bir xil masofada zina hosil qilib, simmetrik uzish paydo qiladi. Bu bir-biriga komplementar uchastkalar asosining juftlashishi hisobiga • yoki «yopishqoq» uchlari orqali birlashish tendensiyasiga ega bo’ladi.
Asoslarning juftlashishi faqatgina komplementar izchilliklar o‘rtasida sodir bo’ladi, shuning uchun EcoRI ta’sirida paydo bo‘lgan AATTuchlar, masalan, Hind III tomonidan hosil qilingan AGCT-uchlar bilan qovushmaydi. Lekin bir restriktaza ta’sirida hosil qilingan har qanday DNK bo‘laklari (kelib chiqishidan qat’i nazar) komplementar nukleotidlarning bir zanjirli uchastkalari orasida vodorod bog‘lari hosil qilish hisobiga birikishi mumkin.
Restriktaza ligaza usuli
U birinchi marta 1973 yilda S. Koen tomonidan qo'llanilgan.Cheklash fermentlari DNK zanjirlariga tanib olish joyining markazidan teng masofada simmetrik, qiyshiq intervalgacha bo'lgan uzilishlarni kiritadi va "qadam" hosil qiladi.
Rekombinant molekulalar hosil qilish ishlarini ligaza fermenti yakunlaydi. Bunday tajribalar birinchi marta 1972-yilda (R.Berg, AQSH) bajarilgan va «yopishqoq» uchlar hosil qiluvchi restriktazalar bilan DNK ligazadan birgalikda foydalanish rekombinant DNK molekulasi olishning umumiy usullarini yaratishda asos bo‘lib xizmat qilishi ko'rsatilgan. Shu laboratoriyada birinchi marta SV40 virusi va E.colining galaktoza operonini tutuvchi A bakteriyafagi rekombinant DNKsiga biriktirilgan.
«To‘mtoq» uchli fragmentlarni birlashtirish usuli. Restriksiya sayti ichida to‘g‘ri uzish hosil qiluvchi restriktazalar ta’sirida «to‘mtoq» uchli DNK fragmentlari paydo bo‘ladi, ularni ham DNK-ligaza fermenti yordamida biriktirish mumkin.
Bunday hollarda ligirlash reaksiyasi o‘ziga xos bo’lib, uning samara darajasi «yopishqoq» uchlarni biriktirishga nisbatan bir oz pastroq. Ammo «to‘mtoq» uchli fragmentlar biriktirishining «yopishqoq» uchli fragmentlarni biriktirishga nisbatan afzalligi shundaki, «to‘mtoq» uchli bu fragmentlar qaysi restriktaza ta’sirida paydo bo‘lishidan qat’i nazar, turli restriktazalar tomonidan hosil bo‘lgan fragmentlarda oson birikadi.
«Yopishqoq» va «to‘mtoq» uchli DNK fragmentlarni biriktirish usuli. DNKning «yopishqoq» uchli fragmentlarini fermentativ yo‘l bilan «to‘mtoq» uchli DNK molekulasiga biriktirish mumkin. Buning uchun «yopishqoq» uchlar «to‘mtoq» uchlarga aylantiriladi, ya’ni DNKning faqat bir zanjirli uchastkalarini gidrolizlovchi SI nukleaza fermenti yordamida «yopishqoq» uchlardagi nukleotidlar kesiladi yoki DNK polimeraza I yordamida bir zanjirli «yopishqoq» uchlaridan ikkinchi zanjir sintezlanadi, ya’ni qo‘shimcha nukleotidlar qo‘shiladi. Shunday usulda «yopishqoq» uchli DNK fragmentlaridan «to‘mtoq» uchli fragmentlar hosil qilinadi va u boshqa «to'mtoq» uchli DNK fragmentlariga DNK ligaza fermenti yordamida biriktiriladi. DNK fragmentlari probirkada birlashtirilganidan so‘ng, ularni tirik hujayralarga kiritish kerak. Buning uchun maxsus vektor molekulalardan foydalaniladi.
Konnektor usuli
To'ldiruvchi bo'lmagan "to'mtoq" uchlari bo'lgan gen va vektor uchun qo'llaniladi.
Birinchi marta 1972 yilda P. Berg tomonidan ijro etilgan. Ekzonukleaza to'mtoq uchlarini kesadi. Terminal transferaza bog'lovchi molekulalarni tikadi vektor DNK fragmentlarining 3' uchiga bir ipli oligo (dA) segmentlari va transgen fragmentining 3' uchiga oligo (dT) segmentlari qo'shiladi. bog‘lovchilar (dA)- va (dT)-ketma-ketliklarning to‘ldiruvchisi orqali bog‘lanadi.
Gen klonlashda rekombinant DNK texnologiyasi
Nukleotidlar ketma-ketliklarini aniqlash - sekvenirlash. DNK ning genetik muhim qismlarini aniqlash imkonini beruvchi usullar muhim ahamiyat kasb etadi.
Sekvenirlash DNK ni restriksion endonukleazalar bilan qirqish orqali hosil bo‘lgan 350-1000 juft nukleotid va undan ortiq ketmaketlikdan iborat bo’laklarning nukleotid asoslari izchilligini aniqlash imkonini beradi. Sekvenirlashining ikkita asosiy tamoyili: kimyoviy va fermentativ sekvens mavjud.
Kimyoviy sekvens nukleotidlarning tanlab kimyoviy degradatsiya qilinishiga asoslangan. U 1977-yilda A.M. Maksam va V. Gilbert tomonidan taklif etilgan va ularning nomi bilan ataladi. Bu usulda sekvenirlashda DNK ning bir zanjirli molekulasini olish zarur, uning bir uchini 32P izotopi bilan nishonlanadi, nishonlangan DNK preparati to‘rt bo‘lakka bo’inadi va har biriga to‘rt asosni bir yoki ikkiga bo‘luvchi maxsus reagent bilan ishlov beriladi. Masalan, 60%-li chumoli kislotasini qo'shish purin asoslari (A+G) ni, dimetilsulfat faqat guanin asoslarini; toza gidrazin esa pirimidin asoslari (T+C) ni parchalaydi, 1,5 normalli Nacl eritmasida esa faqat sitozinli asoslar parchalanadi.
Natijada nishonlangan bo‘laklar to‘plami olinib, ularning uzunligi shikastlangan asosdan to molekulaning oxirigacha bo‘lgan masofada aniqlanadi. To‘rttala reaksiya natijasida hosil bo’lgan bo‘laklarni denaturatsiyalovchi sharoitda akrilamid gelida to‘rtta qo‘shni yo'lakchalarga quyib chiqiladi. Shundan so‘ng radioavtografiya amalga oshiriladi, natijada radioaktiv nishonga ega bo‘laklar rentgen plyonkasida iz qoldiradi. Ularning joylashuviga ko‘ra, nishonlangan qismdan shikastlangan asos qanday masofada joylashganini, buni o‘rganish orqali ularning holatini aniqlash mumkin. Rentgen plyonkasidagi chiziqlar yig‘indisiga ko‘ra, tahlil qilinadigan DNK bo‘lagining nukleotid ketma-ketligi aniqlanadi.
Ushbu usul yordamida qisqa muddat ichida SV40 virusi, pBR322 plazmidasi va boshqa ko‘plab organizmlar DNK ketma-ketliklarini to‘liq aniqlashga muvaffaq bo'lingan. Biroq Maksam-Gilbert usuli muolajalarining sezilarli darajada qiyinligi va uzoq davom etishi bilan bog‘liq bir qator kamchiliklarga ega. Hozirgi vaqtda kimyoviy degradatsiya yordamida sekvenirlash asosida nukleotid ketma-ketliklarini tez va mukammal aniqlash usullari ishlab chiqilgan bo‘lib, qattiq fazali sekvenirlash va aylanma fazali xromotografiyadan foydalanish orqali ham sekvenirlash amalga oshiriladi.
Fermentativ sekvenirlash Senger tomonidan 1977-yilda taklif etilgan nukleotidi zanjirni terminatsiyasi (sintezni to‘xtatib qo‘yish) yo‘li bilan sekvenirlash usuli keng qo‘llaniladi. Senger usuli negizida (komplementar) DNK zanjirining replikatsiyasi tamoyili yotadi. U DNK ketma-ketligi sintezi uzilgan, ya’ni zanjir o‘sishi terminatsiyaga uchragan turli qismlarida amalga oshadi. Fermentativ sekvenirlashning asosiy xossasi tuzilayotgan zanjir sintezining terminatsiyasiga asoslanadi.
Replikasiyani to‘xtatishga sabab bo‘ladigan terminatsiya agentlari 2', —3'-didezoksitrifosfatlar (ddATP, ddGTP, ddTTP, ddCTP) hisoblanadi. Mazkur modifikatsiya qilingan azotli asoslar keyingi dezoksiri bonukleotid bilan fosfodiefir bog‘larni hosil qila olmaydi.
Senger bo'yicha sekvenirlash negizida DNK ning replikatsiyasi yotadi, bunda asosiy ferment DNK polimeraza (asosan, DNKpolimeraza I hisoblanadi. Bir zanjirli DNK-matritsa kalta nukleotid praymer va komplementar nukleotidlar ishtirokida DNKning ikkinchi zanjiri sintezi amalga oshadi. Bunda zanjir uzayishi toki dezoksinukleotidga birikishiga qadar davom etadi, natijada oxirgisining birikishi sintezni to‘xtatilishiga olib keladi.
Probirkalarga to'rtta bir. xil tarkib: nukleotid ketma-ketligi oldindan aniqlab olingan DNK matritsaning denaturlangan bo‘lagi, to'rtta dezoksinukleotid, DNK-matritsaga komplementar bo‘lgan va undan DNK polimeraza I sintezini davom ettiradigan hamda DNK polimeraza I fermentining o‘zi, radioaktiv nishonlangan qisqa praymer (16-24 n.j) dan iborat reaksion aralashma solinadi. Shundan so‘ng har bir probirkaga didezoksinukleotidlardan biri qo‘shiladi. Har bir probirkada sintezlanadigan zanjir DNK polimeraza I didezoksinukleotidni biriktirib oladigan joyda terminatsiyalanadi. Didezoksinukleotid reksiya aralashmasiga qo'shilgan bo‘lib, bitta probirkadagi sintez komplementar zanjirning ddATP bilan bog‘lanishi hisobiga, ikkinchisida ddGTP hisobiga uziladi va h.k. Zanjir uzilishi tasodifiy nuqtalarda amalga oshishi hisobga olinadigan bo‘lsa, praymerdan boshlab sekverinirlanadigan bo‘lak oxiriga qadar uzunlikdagi fragmentlar yig'indisi hosil bo‘ladi.
Olingan DNK fragmentlari poliakrilamidli gelda (bitta nukleotidga qadar aniqlikda) ajratiladi, radioavtografiya qilinadi va to‘rtta probirkadagi bo‘laklarning ajralishining ko‘rinishiga asosan DNKning nukleotid izchilligi aniqlanadi. Bunday axborotga ega bo‘lgach, DNK ga biologik muhim qismlarni joylashtirish mumkin. Masalan, SV40 virusi replikatsiyasi bitta maxsus Hind III nuqtadan boshlanadi va ikkala yo‘nalishda davom etadi. Restriksion xaritalar va restriksion bo‘laklar virus oqsillari uchun mRNK sintezlanadigan DNK bo’laklarini xaritalashda foydalanilgan.
Hozirgi vaqtda istalgan DNK bo'lagining nukleotid ketma-ketligini to’liq aniqlash yechimi topilgan. Bugungi kunda pro va eukariotlarning bir necha minglab genlari nukleotid ketma-ketligi o‘rganilgan. Ko‘plab prokariot organizmlar genomining nukleotid ketma-ketligi aniqlangan. Eukariotlardan achitqilar (Sacharomyces cerevisiae), nematodalar (C.elegans), arabidopsis, drozofilla pashshasi va odam genomini to‘liq sekvenirlashga muvaffaq bo‘lingan.
|
