|
-ma’ruza. Rekombinant DNK konstruksiyalarini yaratishda asosiy vektorlar
|
| bet | 6/14 | | Sana | 27.05.2024 | | Hajmi | 15,56 Mb. | | #255427 |
Bog'liq Gen muhandisligi mavzular to\'plami4-ma’ruza. Rekombinant DNK konstruksiyalarini yaratishda asosiy vektorlar
Reja:
1. RekombinantDNK to‘g‘risida tushuncha.
2. Rekombinant DNK olish usullari
3.Vektor molekulalar, genlar bibliotekasini yaratish.
4.Individual genlarni ajratish texnologiyasi.
Mavzu bo‘yicha asosiy tushuncha va iboralar: rekombinant DNK, konnektor, restiktaza-ligaza, linker, vektorlar, kDNK, nukleazalar, DNK polimerazalar, yopishqoq uchli fragmentlar, to‘mtoq uchli fragmentlar.
Ma’ruza mavzusi bayoni
Gen injeneriyasini in vitro sharoitda funksional genetik faol (rekombinant DNK) strukturalar tuzish deb aytish mumkin yoki sun’iy genetik programma yaratish deyish mumkin.
Genetik injeneriyaning paydo bo‘lishi 1972 yilda Berg va uning xodimlari burinchi marta rekombinant DNK yaratishlari bilan boshlanadi. Bu rekombinant DNK OV40 virusi va bakteriofag L DNK si dugal E.coli operoni galaktoza operonidan tuzilgan edi. Geninjeneriyasi boshqa biologiya fanlar kabi bir nechta fanlar kushilishidan paydo buldi. Lekin u molekulyar genetikaning to‘g‘ri avlodi ekanligi anik daliyedir. Gen injeneriyasining shakllanishi genetik enzimologiya va nuklein kislotalar ximiyasining rivojlanishi bilan boglik.
DNK tuzilishi yana ham chukur tushunish uchun nukleotidlar qatorini - gen qismlarini, butun gen va butun xromosomani, aniqlashning usullarini ishlab chikish zarur edi. Nukleotidlar qatori birinchi marta DNKda emas balki tRNKsining 75-80 nukleotiddan iborat qisqa molekulalarida aniklandi.
1964 yilga kelib achitdi tRNKsining alaninli qatori aniklandi. Bu ishni kilish uchun Rebert Xolli va uning xodimlari Kornelli universitetidan, shunday fermentlar olishdiki u tRNKsini tiklab bo‘ladigan darajada qisqa diskret fragmentlarga parchaladi va bu fragmentlarning tartibi oddiy pogonali degradasiya usuli bilan aniklandi.
1975 yilda Uolter Fors RNKli fag MS 2ning RNKsida nukleotidlar qatorini anikladi. Birinchi marta oddiy xromosoma tuzilishi ma’lum buldi. 3ta oqsil aminokislotalariga mas keladigan kodonlar aniklandi. Bu 3ta gen bir nechta aminokislotalar bilan ajratilgan bo‘lib RNK molekulasi oxirida translyasiyalanmaydigan 129 va 174ta (5’ va 3’ qismlarga mos) nukleotidlar borligi aniklandi. Bu yerda ham molekulaning fizik oxiri xech kachon inisiasiya yoki suzasiya signali bo‘lib xizmat kilmaydi.
Gen muxandisligining poydevori-rekombinant DNKlar texnologiyasigenetik struturalarini birga qo‘shish texnikasi molekulyar biologiyanikg eng muhim yutuqlari dandir Bu texnologiyadan foydalaiib zarur mahsulotni (oqsilni) kodirlaydigan DNK molekulasining kichik bir qismi genni kesib olish, uning yot gen bilan kombinasiyasini yaratish, so‘ngra bu yangi genomni munosib hujayralarga kiritib xo‘jayin hujayra DNKsining sintez mexannzmiyordamida ko‘p martalab ko‘paytirish mumkin.
Sun’iy sharoitda rekombinant DNK olish va genlarni klonlashilk bor 1972 yilda AQSH olimlari Boyer va Koen tomonidan amalga oshmrilgai, Bu olimlar E.coli bakteriyasining xromosoma DNKsiga va shu bakteriya plazmidasiga alohida idishlarda E.co - R I restriktaza fermenti bilan ishlov berganlar. Plazmida tarkibida faqat 1 dona E.co -R I restriktaza fermenti tanib kesadigan maxsus nukleotidlar izchilligi bo‘lganligi sababli ferment plazmidaning halqasimon DNK ko‘sh zanjirini faqat bir joyidan kesib, plazmidani "yopishqoq"uchli ochiq holatga o‘tkazadi. Xromosoma DNK molekulasida E.co -R I rsstrpktaza fermenti taniy oladigan maxsus nukleotidlar izchilligi qanday bo‘lsa, bu molekula shuncha bo‘lakka bo‘linadi.
Turli xil o‘lchamga ega bo‘lgan DNK molekulasi elektroforez uslubi yordamida ajratib olinadi. Ajratab olingan "yopishqoq" uchli xromosoma DNKsi bo‘lagi ochiq holatdagi "yopishqoq" uchlipilazmida DNKgi bilan aralashtirilib ligaza fermenti yordamida tiklanadi. Natijada plazmida tarkibiga xromosoma DNK bo‘lagi kiritiladi.Shu boisdan rekombinant DNK ga quyidagicha tarif bershi mumkin:har qanday tirkk organizm irsiy molekulasiniig istalgan bo‘lagini vektor molekulalariga birikishidan hosil bo‘lgan sun’iyDNK rekombinant DNK deyiladi.
Rekombinant DNK olishda uchta- konnektor, restriktaza ligazava linkermolekulalari usullaridan foydalaniladn. Konnektor usulida rekombinasiyada ishtirok etuvchi DNK bo‘dagining 3’ uchiga dezoksinukleotidiltransferaza fermenti yordamida ma’lum uzunlikdagi oligo (dA) - segmenti ulanadi. Ikkinchi uchiga esa oligo ((dT) - segmenti ulanadi. Bu DNK bo‘laklari aralashtirilgaida dA va dT setmentlarning vodorod bog‘lari asosida komplementar birikishi tufayli xalqasimon DNK strukturasi hosil bo‘ladi. Hosil bo‘lgan DNK dagi bir zanjirli bo‘sh joylar DNK-polimeraza1 fermenti yordamida, to‘ldiriladi.
Restriktaza-ligaza usuli eng sodda va oson rekombinant DNK olish usuli hisoblanadi. Bu usulda DNK molekulasi va vektor plazmida "yopishqoq" uchlar hosil qiluvchi restriktaza bilan qirqiladiva aralashtirilgan holda ma’lum sharoitda reassotsiya qilinadi. Komplementarlik xususiyatiga ko‘ra DNK molekulalari o‘zaro vodorod bog‘lari yordamida birikib xalqasimon struktura hogil qiladi va DNK zanjirining birikmagan joylari DNK-ligaza fermenti yordamida ulanadi.
Linker molekulalaridan foydalanish usulida DNK molekulasiga va vektor plazmidaga T4 fag DNK-ligaza fermenti yordamida maxsus nukleotid ketma-ketligiga ega bo‘lgan linker molekula ulanadi. Olingan ikki turdagi DNK molekulasi restriktaza fermenti yordamida qirqilib aralashtirilgan holda reassosiasiya qilinadi. DNK va vektor plazmida molekulalarining birikmagan joylari DNK-ligaza fermenti yordamida ulanadi. Shu yo‘sinda rekombinant DNK molekulasi hosil bo‘ladi.
|
| |
