1-Ma’ruza: Gen muhandisligi faniga kirish
Reja
1. Gen muhandisligini rivojlanish tarixi.
2. Biotexnologiyada gen muhandisligining asosiy yo‘nalishlari.
3. Gen muhandisligi darajalari va bosqichlari.
Gen muhandisligi, ba'zan genetik modifikatsiya deb ataladi, bu organizm genomidagi DNKni manipulyatsiya qilish jarayonidir. Bunda DNK dagi bitta tayanch juftini (AT yoki C-G) o'zgartirish, yoki qo'shimcha gen qo'shish orqali amalga oshirish mumkin.
Shuningdek, boshqa organizmning genomidan DNK bo'laklarini ajratib olish va ularni qiziqtirgan organizmning DNKsi bilan birlashtirish mumkin.
Gen muhandisligi olimlar tomonidan organizmlarning xususiyatlarini yaxshilash va o'zgartirish uchun qo'llaniladi. Gen injeneriyasini viruslardan tortib hayvonlargacha bo‘lgan har qanday organizmga qo‘llash mumkin. Masalan, ozuqaviy qiymati yuqori yoki dori vositalariga nisbatan chidamli oʻsimliklarni yetishtirish uchun genetik muhandislikdan foydalanish mumkin.
Gen muhandisligi orqali ,ko'z rangi, soch rangi pomidor, tarvuz, qulupnay kabi o'simliklarning ranglarini, sovuqda yashay olmaydigan hayvonlarni, sabzavot va mevalarning kattaligini, Issiq hududlarda o'smaydigan sabzavot va mevalarning irsiy xususiyatlarini, masalan, issiq hududlarda yetishtirish qobiliyatini o'zgartirishi mumkin.
Gen muhandisligi tarixi
1880-yil — Gregor Mendel oʻsimliklar ustida olib borgan ishlari bilan zamonaviy genetika asosini qoʻydi.U xarakterli belgilar genlar orqali uzatilishini aniqladi.
1950 yil - Hershey va Chase DNK hujayraning genetik materiali ekanligini isbotladilar.
1953 yil - Uotson va Krik DNKning qo'sh spiral tuzilishini kashf etdilar.
1955 yil - Artur Kornberg va uning hamkasblari DNK polimerazasini ajratib olishdi.
1961 yil - Nirenberg va Matthei genetik kodni kashf qilishdi. Shunga ko'ra, 3 ta asos 1 aminokislotani kodlaydi.
1966 yil - B.Vays C.C.Richardson DNK ligazasini ajratib oldi.
1968 yil - K.W.Wilcox, H.O.Smit va T.J.Kelley birinchi endonukleazalarni ajratib olishdi.
1972 yil - Pol Berg virus DNKsini bakteriyalar DNKsi bilan birlashtirdi.
1973 yil - Birinchi marta begona gen (antibiotikga chidamli) bakteriyaga o'tkazildi.
1975 yil - Asilomarda (AQSh) birinchi marta genetik muhandislik xavfi bo'yicha ilmiy konferentsiya bo'lib o'tdi.
1976 yil - Genetik muhandislik mahsulotlarini sotuvchi birinchi kompaniya GENENTECH tashkil etildi.
1977 yil - Genetik manipulyatsiya qo'llaniladigan bakteriyalar odamlarda o'sishni tezlashtiruvchi gormon ishlab chiqaradi.
1978 yil - genetik barmoq izi topildi. Bu tufayli har bir insonni DNK dan aniqlash mumkin edi.
1980 yil - (AQSh) "yog'li nonvoy" deb nomlangan genetik manipulyatsiya qilingan organizm birinchi marta patentlangan.
1980 yil - kasalliklarni davolash uchun namuna sifatida transgen sichqonlardan foydalangan holda birinchi marta sichqonlarga gen uzatish muvaffaqiyatli amalga oshirildi.
1980 yil - U. Gilbert va F. Sanger DNK ketma-ketligi usuli uchun Nobel mukofotiga sazovor bo'ldi.
1982 yil - Insulin, sanoat miqyosida birinchi genetik muhandislik mahsuloti ishlab chiqarildi.
1983 yil - Barbara Makklintok "sakrash genlarini" kashf etdi va Nobel mukofotiga sazovor bo'ldi.
1987 yil - Qovoqqa qarshi pomidorlar patentlangan.
1988 yil - Sutemizuvchilarga birinchi patent: inson saratoni geni o'tkazilgan "Garvard sichqonchasi".
1990 yil - “Inson genomi loyihasi”ning rasmiy boshlanishi.Taxminiy qiymati: 3 milliard dollar.
1993 yil - Vashington universitetidan Jerri Xollning inson embrionini klonlashi butun dunyoda janjalga sabab bo'ldi.
1994 yil - Ko'krak saratonining irsiy geni topildi.
1994 yil - Oziqlanish qiymatini oshirish uchun Braziliya yong'og'i geniga ega bo'lgan soya, jiddiy allergik reaktsiyalarni keltirib chiqardi va loyiha taqiqlandi.
1997 yil - qo'yning somatik hujayrasidan klonlangan Dolli tug'ildi.
1997 yil - Yevropa Ittifoqida (Yevropa Ittifoqi) genetik manipulyatsiya qilingan oziq-ovqatlarga qarshi tartibga solish qonuniylashtirildi.
1997 yil - Yevropa Ittifoqida birinchi genetik muhandislik oziq-ovqatiga ruxsat berildi: kolza yog'i.
1999 yil - BMT (Birlashgan Millatlar Tashkiloti) ning genetik manipulyatsiya qilingan organizmlar savdosida biologik xavfsizlik to'g'risidagi rezolyutsiyasi Amerika ta'siri ostida muvaffaqiyatsizlikka uchradi.
1999 yil - Odamlarda 33,4 million dona bo'lgan 22-xromosomaning ketma-ketligi tugallandi.
2000 yil - Inson genomi loyihasi rahbarlari va Prezident Klinton inson genomi DNK ketma-ketligining "ishchi loyihasi" tugaganligini e'lon qildi.
Biotexnologiyada gen muhandisligining asosiy yo’nalishlari
1. Inson salomatligi uchun oqsillarni ishlab chiqarish
2. Ayrim gormonlar, antitellar, vitaminlar, antibiotiklar ishlab chiqarish
3. O'ta og'ir sharoitlarda (harorat, qurg'oqchilik, sho'rlanish va boshqalar) yashovchi organizmlarning fermentlari va biomolekulalarini tozalash va ulardan sanoatda foydalanish.
4. Yangi sabzavot va mevalarni ishlab chiqarish
5. Odamlarda zararli genlarni yo'q qilish
6. Vaksinalar, pestitsidlar, dorivor o'simliklar ishlab chiqarish
CRISPR-Cas9 texnologiyasi
Emmanuel Sharpentier va Jennifer Doudna CRISPR-Cas9 genomini tahrirlashni kashf etgani va ishlab chiqqani uchun kimyo bo‘yicha 2020 yilgi Nobel mukofotiga sazovor bo‘ldi. CRISPR-Cas9 - bu genetik muhandislar va tibbiyot tadqiqotchilariga DNK qismlarini qo'shish, olib tashlash yoki o'zgartirish imkonini beruvchi texnologiya. Ilmiy hamjamiyatda katta qiziqish uyg'otadi, chunki u oldingi genlarni tahrirlash usullariga qaraganda tezroq, arzonroq va yuqori aniqlikka ega.
BLAST biologik ketma-ketliklar orasidagi o'xshashlik hududlarini topadi. Dastur nukleotid yoki oqsil ketma-ketligini ketma-ketlik ma'lumotlar bazalari bilan taqqoslaydi va statistik ahamiyatini hisoblab chiqadi.
Gen muhandisligi E. coli va zamburug’lardan juda o'xshash insulin turini ishlab chiqarish uchun ishlatiladi. Ushbu genetik jihatdan o'zgartirilgan insulin "Humulin" deb nomlanadi va 1982 yilda odamlar tomonidan foydalanish uchun litsenziyalangan.
Gen muhandislik jarayoni
1. Plazmid deb ataladigan kichik dumaloq DNK qismi bakteriya yoki xamirturush hujayrasidan olinadi.
2. Molekulyar qaychi vazifasini bajaruvchi restriksion fermentlar yordamida doiraviy plazmiddan kichik bir qism kesiladi.
3. Plazmidda hosil bo'lgan bo'shliqqa inson insulinining geni kiritiladi. Endi bu plazmid genetik jihatdan o'zgartirildi.
4. Genetik jihatdan o'zgartirilgan plazmid yangi bakteriya yoki zamburug’ hujayrasiga o'tkaziladi.
5 Bu hujayra tez bo'linib, insulin ishlab chiqara boshlaydi.
6. Ko'p sonli hujayralarni ishlab chiqarish uchun genetik jihatdan o'zgartirilgan bakteriyalar yoki xamirturushlar kerakli ozuqalar bilan to'ldirilgan katta fermentyorlarda yetishtiriladi. Hujayralar bo'linishi natijasida insulin ishlab chiqariladi.
7. Fermentatsiya tugagach, aralash insulinni chiqarish uchun filtrlanadi.
Gen nuhandisigida qo’llaniladigan model organizmlarni 3-guruhga bo’lish mumkin.
1. Genetik model organizmlar.
2. Eksperimental model organizmlar.
3. Genomik model organizmlar. - Genetik tahlil uchun javob beradi.
Bu organizmlar juda tez ko'payadi va qisqa vaqt ichida ko'p avlod hosil qiladi.
Odatda juda ko'p mutant shaxslar olinadi.
Genetik xaritalarni chiqarish mumkin.
Masalan: Sirka pashshasi, bir hujayrali zamburug'lar, yumaloq chuvalchanglar
Eksperimental model organizmlar
U ishlab chiqaradigan mustahkam embrionlar tufayli rivojlanish biologiyasida namunali organizm sifatida ishlatiladi.
Misol: Gallus gallus (tovuq) va Xenopus laevis (qurbaqa turi) kabilar.
Genomik model organizmlar
Bunday organizmlarning genetik yoki eksperimental afzalliklari va kamchiliklaridan qat'i nazar namunali organizmlar sifatida tanlanadi. Chunki ular evolyutsion rivojlanishda juda muhim nuqtada yoki ularning genomlarining ba'zi sifati ularni o'rganish uchun ideal qiladi.
1-Ma’ruza: Gen muhandisligi faniga kirish
Reja
1. Gen muhandisligini rivojlanish tarixi.
2. Biotexnologiyada gen muhandisligining asosiy yo‘nalishlari.
3. Gen muhandisligi darajalari va bosqichlari.
“Porlok” navli g‘o‘za bugungi kunda O‘zbekistonda genetik muhandislik texnologiyalari yordamida yaratilgan yagona qishloq xo‘jaligi o‘simliklaridir. Birinchi yili 20 gektarga bu nav ekilgan bo‘lsa, bugungi kunda 17 ming gektardan ortiq maydonga ekilgan. Oʻzbekistonda anʼanaviy ravishda yetishtiriladigan, asosan toʻrtinchi-beshinchi turdagi tola beradigan gʻoʻza navlari 1-2 turdagi tola olish imkonini beruvchi nav olindi. Bu paxta navidan sintetik tola yoki yuqori sifatli paxta tolasi qo'shilmagan holda ko'ylak matosi, ya'ni yuqori sifatli mato olish mumkin. Ushbu g‘o‘za navi Fanlar akademiyasi Genomika va bioinformatika markazi, Qishloq va suv xo‘jaligi vazirligi, “O‘zpaxtasanoat” uyushmasi laboratoriyalarida yaratilgan. Bugun ular nafaqat paxta, balki qishloq xo‘jaligi o‘simliklarining yangi navlarini yaratish ustida ishlamoqda.
GENETIK INJENERING TARIXI
1880-yil — Gregor Mendel oʻsimliklar ustida olib borgan ishlari bilan zamonaviy genetika asosini qoʻydi.U xarakterli belgilar genlar orqali uzatilishini aniqladi.
1950 yil - Hershey va Chase DNK hujayraning genetik materiali ekanligini isbotladilar.
1953 yil - Uotson va Krik DNKning qo'sh spiral tuzilishini kashf etdilar.
1955 yil - Artur Kornberg va uning hamkasblari DNK polimerazasini ajratib olishdi.
1961 yil - Nirenberg va Matthei genetik kodni kashf qilishdi. Shunga ko'ra, 3 ta asos 1 aminokislotani kodlaydi.
1966 yil - B.Vays C.C.Richardson DNK ligazasini ajratib oldi.
1968 yil - K.W.Wilcox, H.O.Smit va T.J.Kelley birinchi cheklash endonukleazasini ajratib olishdi.
1972 yil - Pol Berg virus DNKsini bakteriyalar DNKsi bilan birlashtirdi.
1973 yil - Birinchi marta begona gen (antibiotikga chidamli) bakteriyaga o'tkazildi.
1975 yil - Asilomarda (AQSh) birinchi marta genetik muhandislik xavfi bo'yicha ilmiy konferentsiya bo'lib o'tdi.
1976 yil - Genetik muhandislik mahsulotlarini sotuvchi birinchi kompaniya GENENTECH tashkil etildi.
1977 yil - Genetik manipulyatsiya qo'llaniladigan bakteriyalar odamlarda o'sishni inhibe qiluvchi gormon ishlab chiqaradi.
1978 yil - genetik barmoq izi topildi.Bu tufayli har bir insonni DNK dan aniqlash mumkin edi.
1980 yil - (AQSh) "yog'li nonvoy" deb nomlangan genetik manipulyatsiya qilingan organizm birinchi marta patentlangan.
1980 yil - kasalliklarni davolash uchun namuna sifatida transgen sichqonlardan foydalangan holda birinchi marta sichqonlarga gen uzatish muvaffaqiyatli amalga oshirildi.
1980 yil - U. Gilbert va F. Sanger DNK ketma-ketligi usuli uchun Nobel mukofotiga sazovor bo'ldi.
1982 yil - Insulin, sanoat miqyosida birinchi genetik muhandislik mahsuloti ishlab chiqarildi.
1983 yil - Barbara Makklintok "sakrash genlarini" kashf etdi va Nobel mukofotiga sazovor bo'ldi.
1987 yil - Qovoqqa qarshi pomidorlar patentlangan.
1988 yil - Sutemizuvchilarga birinchi patent: inson saratoni geni o'tkazilgan "Garvard sichqonchasi".
1990 yil - Greenpeacening organizmlarni patentlashga qarshi birinchi noroziligi.
1990 yil - “Inson genomi loyihasi”ning rasmiy boshlanishi.Taxminiy qiymati: 3 milliard dollar.
1993 yil - Vashington universitetidan Jerri Xollning inson embrionini klonlashi butun dunyoda janjalga sabab bo'ldi.
1994 yil - Ko'krak saratonining irsiy geni topildi.
1994 yil - Oziqlanish qiymatini oshirish uchun Braziliya yong'og'i geniga ega bo'lgan soya, jiddiy allergik reaktsiyalarni keltirib chiqardi va loyiha taqiqlandi.
1997 yil - qo'yning somatik hujayrasidan klonlangan Dolli tug'ildi.
1997 yil - Evropa Ittifoqida (Yevropa Ittifoqi) genetik manipulyatsiya qilingan oziq-ovqatlarga qarshi tartibga solish qonuniylashtirildi.
1997 yil - Evropa Ittifoqida birinchi genetik muhandislik oziq-ovqatiga ruxsat berildi: kolza yog'i.
1999 yil - BMT (Birlashgan Millatlar Tashkiloti)ning genetik manipulyatsiya qilingan organizmlar savdosida biologik xavfsizlik to'g'risidagi rezolyutsiyasi Amerika ta'siri ostida muvaffaqiyatsizlikka uchradi.
1999 yil - Odamlarda 33,4 million bp bo'lgan 22-xromosomaning ketma-ketligi tugallandi.
2000 yil - Inson genomi loyihasi rahbarlari va Prezident Klinton inson genomi DNK ketma-ketligining "ishchi loyihasi" tugaganligini e'lon qildi.
Hayvondan odamga organ transplantatsiyasi "kserotransplantatsiya" deb ataladi.
Genetika muhandisligi; Bir-biriga bog'liq yoki turli organizmlar o'rtasida genetik materialni almashish va qayta tashkil etishda ishtirok etadigan texnikalar to'plami.
genetik muhandislik organizmlari (GMO); Zamonaviy genetik muhandislik texnikasi yordamida ishlab chiqarilgan organism.
Transgen organizm; Gen yoki genlar, odatda, turli turlardan, zamonaviy genetik muhandislik texnikasi yordamida uzatilgan organizmlar.Genetika injeneriyasining eng qadimiy shakli bo‘lgan selektiv naslchilik tarixi 10 000 yil muqaddam, ya’ni insonlar qishloq xo‘jaligi jamiyatlariga tashkil topgan paytdan boshlanadi.
Genetik muhandislik jarayonini tushuntirishga yordam berish uchun insulinni qondagi qand miqdorini tartibga soluvchi oqsil sifatida ko'rib chiqaylik. Odatda insulin oshqozon osti bezida ishlab chiqariladi; Ammo 1-toifa diabetga chalingan odamlarda insulin ishlab chiqarish bilan bog'liq muammolar mavjud.Shuning uchun diabet bilan og'rigan odamlar qondagi qand miqdorini nazorat qilish uchun insulin in'ektsiyalariga muhtoj. Genetika muhandisligi E. coli kabi bakteriyalar va xamirturushlardan juda o'xshash insulin turini ishlab chiqarish uchun ishlatiladi.
Ushbu genetik jihatdan o'zgartirilgan insulin "Humulin" deb nomlanadi va 1982 yilda odamlar tomonidan foydalanish uchun litsenziyalangan.
Genetik muhandislik jarayoni
1. Plazmid deb ataladigan kichik dumaloq DNK qismi bakteriya yoki xamirturush hujayrasidan olinadi.
2. Molekulyar qaychi vazifasini bajaruvchi restriksion fermentlar yordamida doiraviy plazmiddan kichik bir qism kesiladi.
3. Plazmidda hosil bo'lgan bo'shliqqa inson insulinining geni kiritiladi. Endi bu plazmid genetik jihatdan o'zgartirildi.
4. Genetik jihatdan o'zgartirilgan plazmid yangi bakterial yoki xamirturush hujayrasiga o'tkaziladi.
5. Bu hujayra tez bo'linib, insulin ishlab chiqara boshlaydi.
6. Ko'p sonli hujayralarni ishlab chiqarish uchun genetik jihatdan o'zgartirilgan bakteriyalar yoki xamirturushlar kerakli ozuqalar bilan to'ldirilgan katta fermentatsiya tanklarida etishtiriladi. Hujayralar bo'linishi natijasida insulin ishlab chiqariladi.
7. Fermentatsiya tugagach, aralash insulinni chiqarish uchun filtrlanadi.
8. Keyin insulin tozalanadi va shishalarga yoki insulin qalamlariga solinadi va diabetga chalingan bemorlarga tarqatiladi.
Genetika muhandisligi yana nima uchun ishlatiladi?Genetika muhandisligi juda ko'p foydali ilovalarga ega; shu jumladan, ilmiy tadqiqotlar, qishloq xo'jaligi va texnologiya. O'simliklardagi genetik muhandislik qarshilik, ozuqaviy qiymat va o'sish tezligini oshirish uchun kartoshka, pomidor va guruch kabi ekinlarda tez-tez qo'llaniladi. Hayvonlarda u sutida mukovistsidozni davolovchi oqsillar yoki olimlarning Altsgeymer kabi kasalliklarni o'rganishini osonlashtiradigan
qurtlarni o'z ichiga olgan qo'ylarni ishlab chiqarishda ishlatiladi.
Nematoda qurti C. elegans butun asab tizimida atigi 300 ga yaqin hujayradan iborat jonzotdir. Bu uni Altsgeymer kasalligini o'rganish uchun foydali modelga aylantiradi. Bundan tashqari, bu qurtning deyarli shaffof tabiati nerv hujayralari yashil floresan oqsil bilan etiketlanganda mikroskop ostida turli tuzilmalar va oqsillarni kuzatishni osonlashtiradi.
Bakterial plazmid yordamida genlarni klonlash bosqichlari:
1. Istalgan genni tashuvchi DNK va vektor sifatida foydalanish uchun bakterial plazmid sof olinadi.
2. Klonlanadigan genni tashuvchi DNK fragmenti va plazmid cheklovchi fermentlar bilan kesiladi.
3. Kesilgan plazmid va klonlanadigan genning uchlari komplementar nukleotidlardan iborat. Bu uchlari ligaza fermenti bilan birlashadi va plazmidga klonlanadigan gen qo'shiladi. Bunday holda, plazmid rekombinant DNK molekulasidir, chunki u turli manbalardan olingan ikkita DNKning birikmasidir.
4. Genetik jihatdan o‘zgartirilgan plazmid yana bakteriya hujayrasiga o‘tkaziladi.
5. Bakteriya uning klonini hosil qilish uchun madaniyatda ko'paytiriladi. Plazmidga o'tkazilgan gen klonlanadi va yangi hujayralarga o'tkaziladi. Shunday qilib, bir tirik mavjudotga tegishli gen boshqa tirik mavjudotga yangi metabolik xususiyatni berish uchun ishlatiladi.
Gen terapiyasi
Buzuq genlarni sog'lom genlar bilan almashtirish usuli gen terapiyasi deb ataladi.
Gen terapiyasi bo'yi pastligi, rang ko'rligi, ko'z kasalliklari, agar mavjud bo'lsa, irsiy kasalliklar kabi keraksiz genlarni topish va nazorat qilish, keraklilarini qo'shish va keraksiz genlarni o'chirish imkoniyatiga ega bo'ladi.
gen terapiyasi; Bu saraton, yurak kasalliklari, diabet va gemofiliya kabi ko'plab kasalliklarni davolash uchun umid beradi.
Gen terapiyasida qo'llaniladigan bosqichlar:
1. Oddiy odamdan olingan gen klonlanadi. U RNK versiyasiga tarjima qilingan. U zararsiz virusning RNK genomiga kiritiladi.
2. Bemorning suyak iligidan olingan hujayralar rekombinant virus bilan zararlangan.
3. Virus bemorning hujayralaridagi DNKga oddiy odam genini o'z ichiga olgan genomining DNK nusxasini kiritadi.
Tadqiqotlarda qo'llaniladigan model organizmlarni tanlashda hisobga olinadigan omillar;
- Qisqa hayot davrlari
- Inson genomi bilan yuqori homologiya
- Avlodlararo qisqa vaqt
-embrion rivojlanishini oson kuzatish va aralashuvi
- Eksperimental manipulyatsiyalar uchun mos bo'lish
- Genetik tahlil uchun javob beradi
- Juda ko'p axloqiy muammolarni keltirib chiqarmang
Model organizmlarning 3 xil turi mavjud;
1. Genetik model organizmlar
2. Eksperimental model organizmlar
3. Genomik model organizmlar
Genetik model organizmlar. Genetik tahlil uchun javob beradi.Bu organizmlar juda tez ko'payadi va qisqa vaqt ichida ko'p avlod hosil qiladi. Odatda juda ko'p mutant shaxslar olinadi. Genetik xaritalarni chiqarish mumkin.
2. Eksperimental model organizmlar. U ishlab chiqaradigan mustahkam embrionlar tufayli rivojlanish biologiyasida namunali organizm sifatida ishlatiladi.
3. Genomik model organizmlar. Bunday organizmlarning genetik yoki eksperimental afzalliklari va kamchiliklaridan qat'i nazar namunali organizmlar sifatida tanlanadi. Chunki ular evolyutsion rivojlanishda juda muhim nuqtada yoki ularning genomlarining ba'zi sifati ularni o'rganish uchun ideal qiladi.
CRISPR-Cas9 yordamida genlarni tahrirlash qanday paydo bo'ldi.
Charpentier 2002 yilda Vena universitetida Streptococcus pyogenes kabi bakteriyalar ustida ishlagan. “Go‘sht yeyuvchilar” deb ham ataladigan bu bakteriyalar odamlar uchun eng xavfli patogenlardan (kasallik qo‘zg‘atuvchi mikroorganizmlar va viruslar) hisoblanadi. Ular yumshoq to'qimalarni parchalaydi va ularni qon bilan zaharlanish orqali o'ldirishi mumkin. Charpentier bakteriyalarning gen tizimini o'rganar ekan, qiziqarli kuzatuv o'tkazdi. Muayyan gen ketma-ketligi DNK bo'lagida qayta-qayta takrorlangan, keyinchalik u qisqacha CRISPR deb nomlangan. Eng qizig'i, takrorlashlar orasidagi DNK ketma-ketligi ma'lum bo'lgan turli viruslarning DNKsi bilan bir xil edi. Charpetier CRISPR bakteriyalarning viruslarga qarshi immunitet tizimining bir qismi bo'lishi mumkin deb o'yladi. U o'z kashfiyotini ushbu masalalar bo'yicha mutaxassis Jennifer Doudna bilan o'rtoqlashdi va ikki tadqiqotchi gen tahrirlash kashfiyoti yo'lida birgalikda ishlay boshladilar.
CRISPR-Cas9 qanday ishlaydi?
Bakteriya virusga kirgandan so'ng, agar u o'lmasa va omon qolsa, birinchi navbatda virusning genetik materialining nusxasini CRISPR (DNK) ga qo'shadi, Keyin u Cas9 oqsili ham ishtirok etgan jarayon yordamida virusning DNKsini kesib, uni ikkiga bo‘lishi mumkin bo‘lgan “gen qaychi” ishlab chiqardi. Bu gen-qaychi virus yana bakteriyalar ichiga kirib borganida ishga tushdi va virusning DNKsini parchalashga muvaffaq bo'ldi. Shunday qilib, Bakteriyalar virusga qarshi immunitetga ega bo'lib, virusdan ta'sirlanmaydi. O'zlari kashf etgan mexanizmni soddalashtirib, tadqiqotchilar har qanday DNK ketma-ketligini kesish uchun mo'ljallangan gen qaychi ishlab chiqarishlari mumkin deb o'ylashdi. Birinchi tajribalar ijobiy natijalar berdi. Ular Doudna laboratoriyasida ishlab chiqarilgan genni olib, ushbu genning beshta alohida hududi uchun mo'ljallangan beshta alohida gen qaychi ishlab chiqarishga muvaffaq bo'lishdi.
Charpetier va Doudna 2012 yilda CRISPR/Cas9 bo'yicha o'z maqolalarini nashr etganidan ko'p o'tmay, turli tadqiqot guruhlari bu usul sichqoncha va inson hujayralaridagi genlarni tahrirlash uchun ham ishlatilishi mumkinligini ko'rsatdi. Ilgari hujayralardagi genlarni tahrirlash juda ko'p vaqt talab qiladigan va ba'zan imkonsiz ish edi. Endi har qanday genni CRISPR/Cas9 usuli bilan osongina kesib olish va hujayraning o'z DNK ta'mirlash mexanizmlari yordamida xohlagancha qayta yozish mumkin.
So'nggi sakkiz yil ichida CRISPR/Cas9 genini tahrirlash usuli turli sohalarda qo'llanildi. Masalan, ularning genlarida o'zgarishlar qilish orqali o'simliklarga yangi xususiyatlar berilishi mumkin. Ushbu usul yordamida saraton va turli irsiy kasalliklarni davolash uchun yangi davolash usullari ishlab chiqilmoqda. Viruslar gen makaslarini tanaga o'tkazish uchun ishlatiladigan usullar mavjud. Tanadagi hujayralar genlariga aralashish orqali kasalliklarni davolash uchun tadqiqotlar olib boriladi.
2-ma’ruza:Gen muhandisligining molekulyar asoslari
Reja
1. Gen muhandisligining molekulyar asoslari.
2. Restriktazalar, plazmidalar va transpozonlar haqida tushuncha.
3. Vektorlar va ularga qo‘yiladigan talablar.
Kesuvchi fermentlari - bu qisqa DNK ketma-ketliklarini aniq taniydigan va ushbu ketma-ketliklarga yaqin yoki ichidagi hududlardan DNKni kesib tashlaydigan tuzilmalar. U birinchi marta 1968 yilda K.V.Uilkoks, H.O.Smit va T.S.Kelli tomonidan Haemmophillus influenza bakteriyasidan ajratib olingan. Bu birinchi ajratilgan fermentning nomi Hind II. Cheklovchi fermentlarning aksariyati bakteriyalardan, faqat bir nechtasi viruslar va eukariotlardan ajratilgan. Ba'zi kesuvchi fermentlar uchun DNK zanjiri ikkalasida ham bir xil. Ular "Palindromik ketma-ketliklar" deb ataladi.
Kesuvchi endonukleazlardan foydalanish sohalari
DNKning modifikatsiya holatini tahlil qilish
Problarni tayyorlash
Mutant organizmlarning yaratilishi
DNK molekulasining qayta tashkil etilishi
Populyatsiya polimorfizmini tahlil qilish
DNK xaritasi
Kesuvchi fermentlarining nomi ular ajratilgan bakteriyalar jinsi nomining birinchi harfidan va tur nomining birinchi ikki harfidan iborat.
EcoRI > Escherichia coli
BamHI > Bacillus amyloliquefaciens
HindIII > Haemophillus influenze
PstI < Providencia stuartii
Restriktazalar nukleotid ketma-ketligini qirqishiga qarab bir necha tipga bo’linadi.
1-toifa RE; Bu turdagi fermentlar endonukleaza faolligi uchun ATP, S-adenosilmetionin va mg+2 ga muhtoj. Barcha ma'lum bo'lgan I turdagi RElar tanib olish ketma-ketligida adenin qoldiqlarini metillashtiradi. Restriksiya aytlarini taniydi,nlekin tanib olgan saytdan ixtiyoriy masofada qirqadi.
II turdagi RE; Ushbu turdagi fermentlar eng ko'p o'rganilgan guruhdir. Izolyatsiya qilingan RE ning aksariyati ushbu guruhga kiradi. Ushbu guruhdagi fermentlar butun maqsadli nukleotidni yoki juda yaqindan kesib o'tish qobiliyati tufayli tadqiqot uchun idealdir. Mg+2 ionlari ishtirokida ular ikki zanjirli DNKdagi palindromik ketma-ketliklarni taniydilar va shu ketma-ketlik ichida o'ziga xos hududdan kesiladi.
III turdagi RE; I turdagi RE kabi, ular metilatsiyani o'zgartirish funktsiyasiga ega. Ular Mg+2 va ATPga bog'liq holda parchalanishni amalga oshiradilar. Ushbu fermentlarning to'liq kesish qobiliyati yomon. Ular tanib olish ketma-ketligidan DNK bilan bog'langan bo'lsalar ham, ular kesishni tanib olish joyidan boshqa joydan amalga oshiradilar. DNK ni tanib olingan saytdan 20-35 n j masofada gidroliz qiladi.
Homing endonukleazlar; Ular oqsil tuzilishi jihatidan boshqa RE lardan farq qiladi. Ular uzoq va assimetrik joylarni taniydilar va kesishadi. Ularning faoliyati uchun protein va RNK kerak. Ular tanib olish joylarida bitta asosiy o'zgarishlarga toqat qila oladilar.
Nicking endonukleazlar; RE ikki zanjirli DNK bilan bog'lanadi va kesiladi. Bitta zanjirli bog'lovchi endonukleaza faolligini ko'rsatadigan fermentlar guruhi "Niking" endonukleazalar deb ataladi.
5’GAATTC 3’
3’CTTAAG 5’ Eco RI restriktazasi restriksiya sayti.
5’TAGA 3’
3’ATCT 5’ Taq I restriktazasi restriksiya sayti.
Ikkinhi tipdagi restriktazalar restriksiya saytlari o’lchami va olinadigan DNK bo’laklari uzunligiga qarab bir necha sinfga bo’linadi.
1 mayda bo’laklarga bo’luvchichilar restriksiya saytlari to’rtta nukleotid juftliklardan iborat.
2. O’rta bo’lakka bo’luvchi 6-8 nj restriksiya saytlari.
3. Yirik bo’lakka bo’luvchilar 10-14 nj restriksiya saytlari.
Transpozonlar bitta hujayra ichidagi gen bo'laklari bo'lib, ular ko'pincha joylashuvidan ajralib, turli hududlarga "sakrab" ketadilar. Transpozonal o'tishlar transpozonal hududlar ko'rinishida bo'lishi mumkin, avvalo o'zlarini nusxalash va keyin bu nusxalarni sakrash orqali o’tadi. Transpozonlarning ahamiyatini juda oddiy jumla bilan izohlashimiz mumkin: deyarli barcha yuqori eukariotlar genomlarining o'rtacha 50% transpozonlardan iborat.
Transpozonlarning turlari
Birinchi sinf transpozonlari
Birinchi toifadagi transpozonlar yoki retrotranspozonlar o'z-o'zidan nusxa ko'chirishadi va bu nusxa sakrab DNKning boshqa joyiga yopishishi mumkin. Shu maqsadda DNK dan transkripsiya mexanizmi orqali kichik DNK segmentlari ishlab chiqariladi; Keyinchalik, ushbu RNK yordamida DNK teskari transkripsiya usuli bilan sintezlanadi (retroviruslar va retrotranspozonlar Markaziy Dogma qoidasini buzadigan elementlardir). Ishlab chiqarilgan bu retrotranspozon xuddi retroviruslar kabi harakat qiladi. U DNKdan ajralib chiqishi, DNKning boshqa hududiga yopishishi va ba'zi hollarda hatto hujayradan tashqariga chiqib, boshqa hujayraning DNKsiga yopishishi mumkin.
Retrotranspozonlarning uchta kichik guruhi ham kashf etilgan
1) Virusli retrotranspozonlar RNK dan DNKni sintez qila oladigan “teskari transkriptaza" fermentlarini kodlaydi. Ularning genetik tuzilmalarida uzoq muddatli takrorlanishlar mavjud. Ular xuddi retroviruslarga o’xshaydi. Ularning uzunligi taxminan 100-5000 ta nukleotid juftidan iborat bo’ladi. Ular inson genomining taxminan 8% va sichqon genomining taxminan 10% ni tashkil qiladi.
2) Uzun interspersed nukleotid elementlar deb nomlangan retrotranspozonlar teskari transkriptaza fermentlariga ega va RNKdan DNKni sintez qila oladi. Shuningdek, u ko'p nukleotidli ketma-ketliklarning o'rta hududlaridagi fosfodiester aloqalarini deyarli barchasida endonukleaza fermentlarini olib o'tish orqali buzishi mumkin. Biroq, ular uzoq tugaydigan kodlarni olib yurmaydilar va RNK polimeraza II fermenti orqali ko'payadilar. Odam genomning 17% ni tashkil qiladi
Short Interspersed nukleotid elementlari deb nomlanadigan retrotranspozonlar (uzunligi 500 ta asosiy juftdan kam bo'lgan transpozonlar. RNK polimeraza III fermenti tomonidan ajratilgan tRNK rRNK kabi fragmentlarning teskari transkripsiyasi orqali hosil bo'ladi. Ularda funktsional teskari transkriptaza fermentlari mavjud emas va faqat u yerda ajralib chiqqan fermentlar yordamida turli joylarga o'tish orqali o'zlarini ko'paytirishlari mumkin. Ular inson genomining 11% ni tashkil qiladi. Garchi ularning aksariyati keraksiz DNK (ya'ni evolyutsiya jarayonida o'z funktsiyalarini yo'qotgan genlar) sifatida ko'rilsa-da, ularning ba'zilari hali ham ishlashi mumkin.
Ikkinchi sinf transpozonlari
Ikkinchi sinf transpozonlari, DNK transpozonlari sifatida ham tanilgan, birinchi sinfdan farqli o'laroq, o'zlarini ko'paytirmaydilar va ular o'zlari kabi almashtiriladi. Ushbu transpozonlarning sakrashlari transpozaza deb ataladigan fermentlar tomonidan ta'minlanadi. Ushbu fermentlarning ba'zilari transpozonlarni faqat DNKning ma'lum hududlari bilan bog'lashi mumkin, boshqalari esa DNKning deyarli har qanday mintaqasi bilan bog'lanishi mumkin. Asosan, ferment DNKning transpozonal qismini kesib, ikkala uchida "yopishqoq" qismlarni qoldiradi. DNK polimeraza va DNK ligaza fermentlari tufayli ular sakrab o'tadigan joy to'ldiriladi. Bu jarayonlarda mutatsiyalarning yuzaga kelish ehtimoli ham juda yuqori. Ba'zida bunday transpozonlar o'zlarini takrorlashlari ham aniqlangan.
Vektorlar
Ular maxsus nukleotidlar ketma-ketligidan kesilgan DNK fragmentlarini retsipient hujayraga o'tkazishni ta'minlaydigan tuzilmalardir.
Vektor quyidagi xususiyatlarga ega bo'lishi kerak:
Qabul qiluvchi hujayraning o'z xromosomasidan mustaqil ravishda ko'payish qobiliyatiga ega bo’lishi. Replikatsiyani ta’minlaydi.
U boshqa hujayralar orasidan tanlanish qobiliyatini beradigan genni olib yurishi kerak. Bular antibiotiklarga qarshilik yoki metallga qarshilik kabi genlar bo'lishi mumkin.
U atrof-muhitdan alohida molekula sifatida ajratilishi kerak. Agar bu virus bo'lsa, u bakterial xromosomaga qo'shilmasligi kerak.
U bitta, o'ziga xos kesuvchi endonukleazalarga ega bo’lishi kerak.
Bugungi kunda vektor tizimlari quyidagilardan iborat:
Plazmid vektorlari
virusli vektorlar
Eksperission (shuttle) vektorlari
Ti plazmid
kosmid vektorlari
Yac vektor
2-ma’ruza: Gen muhandisligining molekulyar asoslari
Reja
1. Gen muhandisligining molekulyar asoslari.
2. Restriktazalar, plazmidalar va transpozonlar haqida tushuncha.
3. Vektorlar va ularga qo‘yiladigan talablar.
Kesuvchi fermentlari - bu qisqa DNK ketma-ketliklarini aniq taniydigan va ushbu ketma-ketliklarga yaqin yoki ichidagi hududlardan DNKni kesib tashlaydigan tuzilmalar. U birinchi marta 1968 yilda K.V.Uilkoks, H.O.Smit va T.S.Kelli tomonidan Haemmophillus influenza bakteriyasidan ajratib olingan. Bu birinchi ajratilgan fermentning nomi Hind II. Cheklovchi fermentlarning aksariyati bakteriyalardan, faqat bir nechtasi viruslar va eukariotlardan ajratilgan.
Ba'zi kesuvchi fermentlar uchun DNK zanjiri ikkalasida ham bir xil. Ular "Palindromik ketma-ketliklar" deb ataladi. Cheklovli endonukleazlarning tabiiy biologik funktsiyasi ularning bakterial mudofaa mexanizmidagi rolidir. Ular bakteriyalarga kiradigan begona DNKni ham kesishi mumkinligi sababli ular hujayra ichidagi bakterial patogenlarni faolsizlantirishi va bakteriyalarni viruslar va begona DNKlardan himoya qilishi mumkin.Shu bilan birga, bakteriyalardagi o'ziga xos metilaz fermentlari cheklash joylariga metil guruhlarini qo'shib, cheklash endonukleazalarining bakteriyalarning o'z DNKsini kesishiga yo'l qo'ymaydi.
Kesuvchi endonukleazlardan foydalanish sohalari
DNKning modifikatsiya holatini tahlil qilish
Problarni tayyorlash
Mutant organizmlarning yaratilishi
DNK molekulasining qayta tashkil etilishi
Populyatsiya polimorfizmini tahlil qilish
DNK xaritasi
Cheklovchi fermentlarning nomenklaturasi
Cheklash fermentlarining nomi ular ajratilgan bakteriyalar jinsi nomining birinchi harfidan va tur nomining birinchi ikki harfidan iborat.
EcoRI > Escherichia coli
BamHI > Bacillus amyloliquefaciens
HindIII > Gemofil grippi
PstI < Providencia stuartii
Sau3AI > Staphylococcus aureus
Ba'zi cheklash fermentlari va tanib olish joylari
Cheklovchi fermentlarning tasnifi
1-toifa RE; Bu turdagi fermentlar endonukleaza faolligi uchun ATP, S-adenosilmetionin va mg+2 ga muhtoj. Barcha ma'lum bo'lgan I turdagi RElar tanib olish ketma-ketligida adenin qoldiqlarini metillashtiradi.
II turdagi RE; Ushbu turdagi fermentlar eng ko'p o'rganilgan guruhdir. Izolyatsiya qilingan RE ning aksariyati ushbu guruhga kiradi. Ushbu guruhdagi fermentlar butun maqsadli nukleotidni yoki juda yaqindan kesib o'tish qobiliyati tufayli tadqiqot uchun idealdir. Mg+2 ionlari ishtirokida ular ikki zanjirli DNKdagi palindromik ketma-ketliklarni taniydilar va shu ketma-ketlik ichida o'ziga xos hududdan kesiladi.
III turdagi RE; I turdagi RE kabi, ular metilatsiyani o'zgartirish funktsiyasiga ega. Ular Mg+2 va ATPga bog'liq holda parchalanishni amalga oshiradilar. Ushbu fermentlarning to'liq kesish qobiliyati yomon. Ular tanib olish ketma-ketligidan DNK bilan bog'langan bo'lsalar ham, ular kesishni tanib olish joyidan boshqa joydan amalga oshiradilar. Homing endonukleazlar; Ular oqsil tuzilishi jihatidan boshqa RE lardan farq qiladi. Ular uzoq va assimetrik joylarni taniydilar va kesishadi. Ularning faoliyati uchun protein va RNK kerak. Ular tanib olish joylarida bitta asosiy o'zgarishlarga toqat qila oladilar.
Nicking endonukleazlar; RE ikki zanjirli DNK bilan bog'lanadi va kesiladi. Bitta zanjirli bog'lovchi endonukleaza faolligini ko'rsatadigan fermentlar guruhi "Niking" endonukleazalar deb ataladi.
Nima uchun endonukleazalarni cheklovchi fermentlar deyiladi? Endonukleazlar cheklovchi fermentlar deb ataladi. U "molekulyar qaychi" deb ham ataladi, chunki u DNKning qo'sh spiral zanjirini ma'lum nuqtalarda kesib tashlaydi. Ushbu hududlar yoki joylar tanib olish joylari deb ataladi. Deyarli barcha cheklovchi endonukleazlar o'ziga xos tanib olish joyiga ega.
Ular DNKni ma'lum joylarda taniganliklari va kesishganliklari sababli, restriksion endonukleazlar bakteriofaglarning ko'payishini cheklagani uchun shunday nomlanadi. Cheklovlar endonukleazlar quyidagi maqsadlarga xizmat qiladi: To'liq DNK ketma-ketligi palindromik tanib olish ketma-ketligi uchun har bir endonukleaza tomonidan tekshiriladi. Endonukleaza cheklovchi fermentlar qanday?
Restriksiya fermenti deb ataladigan bakterial oqsil, shuningdek, cheklovchi endonukleaza sifatida ham tanilgan, DNKni molekulaning ma'lum joylarida parchalaydi. Cheklov fermentlari bakterial hujayra ichidagi begona DNKni parchalash orqali infektsiyalangan organizmlarni o'ldiradi.
Endonukleazlar deb ataladigan fermentlar polinukleotid zanjirlarida joylashgan fosfodiester aloqasini buzadi. Ko'pchilikka ma'lum bo'lgan ko'plab DNK-kesuvchi fermentlar, restriksion endonukleazlar yoki cheklovchi fermentlar faqat juda o'ziga xos nukleotidlar ketma-ketligida bo'linadi, ba'zilari, masalan, dezoksiribonukleaza I, DNKni nisbatan o'ziga xos bo'lmagan tarzda kesib tashlaydi. Oxirgi bir necha maqolalarimizda evolyutsiya ikkinchi darajali; ammo biz xilma-xillikni yaratish uchun juda muhim bo'lgan ba'zi mexanizmlarni tasvirlaymiz. Shu tarzda, siz mutatsiyalar evolyutsiyaning xilma-xilligi uchun zarur bo'lgan yagona mexanizm emasligini ko'rishni boshlaysiz degan umiddamiz. Yodingizda bo'lsa, avvalgi maqolamiz Gen transferi yoki Crossingover haqida edi. Ushbu maqolada biz o'zgarish va xilma-xillikning yana bir muhim mexanizmi Transpozonlar haqida gapiramiz.
Transpozonlar bitta hujayra ichidagi gen bo'laklari bo'lib, ular ko'pincha joylashuvidan ajralib, turli hududlarga "sakrab" ketadilar. Transposonal o'tishlar transposonal hududlar ko'rinishida bo'lishi mumkin, avvalo o'zlarini nusxalash va keyin bu nusxalarni sakrash (siz buni kompyuterda "Copy/Paste" operatsiyasi kabi tasavvur qilishingiz mumkin); Bu gen bo‘laklari bo‘lgan joydan uzilib, yangi joyga joylashishi ko‘rinishida ham bo‘lishi mumkin (siz buni kompyuterda “Kesish/qo‘yish” operatsiyasi kabi tasavvur qilishingiz mumkin). Misol uchun, quyidagi rasmda sariq-to'q sariq-sariq ranglarda ko'rsatilgan transpozonal element o'zini ko'paytirdi va qarama-qarshi tomonga sakrab chiqdi va odatda birlashtirilgan binafsharang genlar ketma-ketligining o'rtasiga yopishib oldi:
Transpozonal sakrashlar haqiqatan ham juda muhim evolyutsion mexanizmdir, chunki ular fenotipni tubdan o'zgartirishi mumkin bo'lgan ta'sirga ega, shuningdek, genom hajmini o'zgartiradi. Bu genom hajmiga, ayniqsa eukaryotik hujayralarga juda jiddiy ta'sir ko'rsatadi. Chunki transpozon o'zini nusxalashi va o'zini ham, nusxasini ham DNKning turli hududlariga joylashtirishi mumkin. Shu tarzda, u genomning o'sishiga olib keladi. Agar bu o'zgarish tirik mavjudotga afzallik bersa, u kelajak avlodlarga o'tadi. Shunday qilib, tirik mavjudotlarning genom o'lchamlari uzoq evolyutsiya jarayonida o'zgaradi. Bundan tashqari, transpozonal sakrashlar va ularning turli turlarda saqlanishini taqqoslash orqali juda ishonchli evolyutsion tahlillarni amalga oshirish va turlarning bir-biriga bog'liqligini tekshirish mumkin. Bularning barchasidan biz transpozonlarning evolyutsion ahamiyatini tushunishimiz mumkin. Ushbu muhim mexanizm Barbara Makklintok tomonidan kashf etilgan va kashfiyotchi 1983 yilda Nobel mukofotiga sazovor bo'lgan. Makklintok transpozonlar bo'yicha o'z tadqiqotlarini 1944 yilda boshlagan, 1950 yilda ushbu mavzu bo'yicha o'zining eng mashhur maqolasini nashr etgan va 1983 yilgacha davom etgan kashfiyotning ahamiyati ilmiy jamoatchilik tomonidan tan olingan va taqdirlangan.
Transpozonlarning ahamiyatini juda oddiy jumla bilan izohlashimiz mumkin: deyarli barcha yuqori eukariotlar genomlarining o'rtacha 50% transpozonlardan iborat. Bu katta transpozonal genlar genom bo'ylab tarqalgan. Bu erda evolyutsion biologlar va populyatsiya genetiklari ushbu transpozonlarning joylashishini aniqlaydilar, ushbu transpozonlarning o'zaro bog'liq turlarda bir xil joylarda mavjudligini tekshiradilar va ularning evolyutsion yaqinligi va masofasini, taksonomik jihatdan qayerga tegishli ekanligini va hokazolarni aniqlaydilar. muhim natijalarga erishish mumkin.
Transpozonlarning turlari
Yuqorida aytib o'tganimizdek, transpozonlarning ikki turi mavjud.
A) Birinchi sinf transpozonlari
Birinchi toifadagi transpozonlar yoki retrotranspozonlar o'z-o'zidan nusxa ko'chirishadi va bu nusxa sakrab DNKning boshqa joyiga yopishishi mumkin. Shu maqsadda DNK dan transkripsiya mexanizmi orqali kichik DNK segmentlari ishlab chiqariladi; Keyinchalik, ushbu RNK yordamida DNK teskari transkripsiya usuli bilan sintezlanadi (retroviruslar va retrotranspozonlar Markaziy Dogma qoidasini buzadigan elementlardir). Ishlab chiqarilgan bu retrotranspozon xuddi retroviruslar kabi harakat qilishi mumkin. U DNKdan ajralib chiqishi, DNKning boshqa hududiga yopishishi va ba'zi hollarda hatto hujayradan tashqariga chiqib, boshqa hujayraning DNKsiga yopishishi mumkin. Bunday holda, biz uni plazmid kabi harakat qilishimiz mumkin; Buni keyingi maqolamizda tushuntiramiz. Siz asosan transpozonlarni OIV viruslari kabi harakat qilish deb o'ylashingiz mumkin.
Retrotranspozonlarning uchta kichik guruhi ham kashf etilgan.
1) Virusli retrotranspozonlar RNK dan DNKni sintez qila oladigan "orqa transkriptaza" fermentlarini kodlaydi. Ularning genetik tuzilmalarida uzoq muddatli takrorlanishlar mavjud. Ular xuddi retroviruslarga o'xshaydi. Ularning uzunligi taxminan 100-5000 ta asosiy juft bo'lishi mumkin. Ular inson genomining taxminan 8% va sichqon genomining taxminan 10% ni tashkil qiladi. Bu kichik guruhga mansub ikki xil: suvoʻtlardan angiospermlargacha, gimnospermlargacha boʻlgan koʻplab tirik mavjudotlarda uchraydigan Ty1-copia retrotranspozonlari va koʻplab tirik mavjudotlarda ham topilgan Ty3-loli retrotranspozonlari topilgan.
2) Uzun interspersed nukleotid elementlar (LINE: Long Interspersed nucleotide Elements) deb nomlangan boshqa guruhda to'liq uzunlikdagilar teskari transkriptaza fermentlariga ega va RNKdan DNKni sintez qila oladi. Shuningdek, u ko'p nukleotidli ketma-ketliklarning o'rta hududlaridagi fosfodiester aloqalarini deyarli barchasida endonukleaza fermentlarini olib o'tish orqali buzishi mumkin. Biroq, ular uzoq tugaydigan kodlarni olib yurmaydilar va RNK polimeraza II fermenti orqali ko'payadilar. Odam genomida taxminan 500 000 xil CHIZIK mavjud bo'lib, genomning 17% ni tashkil qiladi. Ularning 7000 ga yaqini to'liq metrajli va orqaga transkripsiyaga qodir.
3) Short Interspersed Nucleotide Elements (SINE: Short Interspersed Nucleotide Elements) - uzunligi 500 ta asosiy juftdan kam bo'lgan transpozonlar. RNK polimeraza III fermenti tomonidan ajratilgan tRNK rRNK kabi fragmentlarning orqa transkripsiyasi orqali hosil bo'ladi. Ularda funktsional orqa transkriptaza fermentlari mavjud emas va faqat u erda ajralib chiqqan fermentlar yordamida turli joylarga o'tish orqali o'zlarini ko'paytirishlari mumkin. Ular inson genomining 11% ni tashkil qiladi. Garchi ularning aksariyati keraksiz DNK (ya'ni evolyutsiya jarayonida o'z funktsiyalarini yo'qotgan genlar) sifatida ko'rilsa-da, ularning ba'zilari hali ham ishlashi mumkin.
B) Ikkinchi sinf transpozonlari
Ikkinchi sinf transpozonlari, DNK transpozonlari sifatida ham tanilgan, birinchi sinfdan farqli o'laroq, o'zlarini ko'paytirmaydilar va ular o'zlari kabi almashtiriladi. Ushbu transpozonlarning sakrashlari transpozaza deb ataladigan fermentlar tomonidan ta'minlanadi. Ushbu fermentlarning ba'zilari transpozonlarni faqat DNKning ma'lum hududlari bilan bog'lashi mumkin, boshqalari esa DNKning deyarli har qanday mintaqasi bilan bog'lanishi mumkin. Asosan, ferment DNKning transpozonal qismini kesib, ikkala uchida biz "yopishqoq" deb ataydigan qismlarni qoldiradi. Bu "yopishqoqlik", albatta, kimyoviy tortishishdan iborat; shuning uchun bu uchlar imkon qadar tezroq ulanishni xohlaydi. DNK polimeraza va DNK ligaza fermentlari tufayli ular sakrab o'tadigan joy to'ldiriladi. Bu jarayonlarda mutatsiyalarning yuzaga kelish ehtimoli ham juda yuqori. Ba'zida bunday transpozonlar o'zlarini takrorlashlari ham aniqlangan.
Transpozonlarning bu ikki klassi ham evolyutsiya jarayonida o'zlarini takrorlash qobiliyatini yo'qotishi mumkin; biroq, ular sakrash xususiyatlarini yo'qotgan holatlar hech qachon bo'lmagan; chunki gen qismini "transpozon" qiladigan narsa uning DNKdan ajralib chiqishi mumkin bo'lgan fermentlarni ajratish qobiliyatidir. Ma'lumki, DNKning yagona vazifasi ishlab chiqariladigan fermentlar va oqsillar ketma-ketligini saqlashdir. Bu erda transpozonlarda kodlangan ketma-ketlik fermentlar bo'lib, ular turgan joydan uzilib, boshqa joyga o'tadi. Bundan tashqari, transpozonlarning sakrash qobiliyatini yo'qotmasligining yana bir sababi, ular atrofdagi transpozonlarning fermentlari yordamida sakrashlari mumkin.
Transpozonlarga misollar
Ko'pgina turlarda yuzlab turli transpozonal genlar topilgan. Bu yerda ularning barchasiga to‘xtalib o‘tishni o‘rinsiz deb bilamiz. Biroq, fikr berish uchun, Zea maysdagi Ac/Dc transpozonlari; Drosophila melanogasterdagi P elementlari va Marinerga o'xshash elementlar; Homo sapiensdagi alu sekanslari; Mu fajning o'zi; Saccharomyces ceravisiae tarkibidagi Ty1, Ty2, Ty3, Ty4 va Ty5 transpozonlari bir necha misoldir. Transpozonlar mutagen ekanligini eslatib o'tmoqchimiz. Chunki transpozon odatda sakrash joyidagi funktsional genni ishlamay qoldiradi. Bundan tashqari, agar transpozon sakrashdan oldin o'zini ko'chirmasa, bo'sh joy tufayli bu gen ham ishlay olmasligi mumkin. Yoki transpozonning o'zi ishlayotgan bo'lsa, o'zini turli joylarda nusxalash va joylashtirish uning funksiyasini ko'p marta ko'rishga olib kelishi mumkin. Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, transpozonlar gemofiliya, og'ir birikmalar himoyasi etishmovchiligi (SCID), porifera, saraton, Duchenne mushak distrofiyasi kabi kasalliklarga olib keladi.Transpozonlar evolyutsiya jarayonida qanday shakllanganligi hali ham qiziq; lekin kundan kun yaxshilanib bormoqda. Tadqiqotlarga ko'ra, transpozonlar retroviruslar kabi barcha tirik mavjudotlarning umumiy ajdodi bo'lgan koaservatlardan beri mavjud bo'lgan deb taxmin qilinadi. Ba'zi olimlarning fikricha, boshidanoq mavjud bo'lgan bu tuzilmalar evolyutsiya jarayonida yana bir necha marta mustaqil ravishda rivojlangan. Transpozonlarning aksariyati olimlar tomonidan "xudbin DNK parazitlari" deb hisoblanadi. Ya'ni transpozonlar DNK yordamida o'zini ko'paytiradi va hujayra resurslaridan foydalanadi; lekin ko'pincha ular o'zlari joylashgan hujayraga zarar yetkazadilar. Boshqa tomondan, ular o'zgaruvchanlikning juda kuchli yaratuvchisidir.
Qizig'i shundaki, tabiatdagi ba'zi tirik mavjudotlar, ayniqsa, ba'zi bakteriyalar transpozonlarning genomlarini buzishining oldini olish mexanizmlarini ishlab chiqdilar. Masalan, ular ba'zi bakteriyalarda joylashgan RNK (RNK shovqini) yordamida sakrash transpozonlarini yo'q qiladi. Xuddi shunday himoya mexanizmlari eukaryotik organizmlarda ham rivojlangan. Inson genomidagi transpozonlarning ba'zilari harakatsiz bo'lib, hujayra tomonidan ajratilgan fermentlar tomonidan harakatlanishiga to'sqinlik qiladi. Fanda bu "Uyqudagi go'zal transpozon tizimi" deb ataladi. Biroq, har bir tirik mavjudot, jumladan, odamlar ham evolyutsiyaga uchraganligi sababli, ba'zi hollarda bu "uxlab yotgan" transpozonlar uyg'onadi va yana faollashadi. Masalan, odamlarda Tc1/marinerga o'xshash transpozon millionlab yillar uyqudan keyin qayta faollashishi aniqlandi.
Transpozonlar bugungi kunda tibbiyotda ham qo'llaniladi. Ayniqsa, gen terapiyasida qo'llaniladigan transpozonlar tashqaridan genlarni qo'shish orqali istalgancha manipulyatsiya qilinadi. Transpozonlarning foydali evolyutsion o'zgarishlarga olib kelishini ko'rsatadigan eng yaxshi tajribalar orasida Lenski va boshqalarning uzoq muddatli E. coli tajribalari mavjud. Lenski va uning hamkasblari 1 ta bakterial hujayradan 12 ta populyatsiyani in vitro sharoitda rivojlanishiga yo'naltirishdi. Yillar o'tib o'tkazilgan tahlilda ular 12 populyatsiyaning barchasi riboza shakarini hazm qilish qobiliyatini sezilarli darajada yo'qotganligini kuzatdilar. Ajdodlar hujayralari yillar o'tib -80 daraja Selsiyda yashiringan joydan olib tashlandi va ular riboza shakarini hazm qilishda muvaffaqiyatli ekanligi isbotlandi. Shunday qilib, riboza hazm qilish avlodlar davomida atrofiyaga uchradi, evolyutsiya yo'li bilan yo'q bo'lib ketdi. Shunday qilib, olimlar ribozani hazm qilish qobiliyati nima uchun barcha 12 populyatsiyada yo'qolganini tekshirishlari kerak edi. Lenski va uning hamkasblari riboza hazm qiluvchi fermentlarni ishlab chiqaradigan bakteriyalarning riboz operonlarining DNKsini tahlil qilishdi. Ma'lum bo'lishicha, ularning barchasida mas'ul genlarida katta o'chirishlar mavjud. Keyin savol berish kerak edi: bu o'chirishlar mutatsiyalar natijasimi yoki transpozonlar kabi kattaroq, tiniq gen o'zgarishlarining ta'sirimi. Ular bu evolyutsion o'zgarishlar foydali mutatsiyalar yoki yo'qligini hisoblashni boshladilar. Ular ajdodlar bakteriyalarini muzlatgichdan olib chiqib, ularga genlarning rivojlangan versiyalarini o'tkazishdi. Ushbu gen hududidan tashqarida izogen bo'lgan ajdod hujayralari in vitro proliferatsiya tezligi bo'yicha raqobatlashdi. O'nlab eksperimental musobaqalar shuni ko'rsatdiki, o'chirilishi bo'lganlar ota-bobolariga qaraganda tezroq ko'payadi va tez orada dominant bo'ladi. Shunday qilib, Lenski tajribasida riboza operonini yo'qotish foydali mutatsiyalar deb ta'riflanishi mumkin. Shunday qilib, mutatsiyalar ta'sir qildi; ammo bu mutatsiyalarni nima qo'zg'atdi? Odatda sodir bo'ladigan nukleotid-nukleotid o'zgarishimi yoki kengroq sabab bormi? Tadqiqotlari natijasida bu oʻchirishlarning barchasi IS transpozoni deb ataladigan element yonida turgan. Bu erda o'chirishlar IS transpozoniga bog'liq edi. Transpozonlar tomonidan yaratilgan mutatsiyalar bakteriyalar uchun foydali bo'lgan. Shunga qaramay, Lenski va uning hamkasblari transpozondan mustaqil o'chirish bakteriyalarga foyda keltiradimi yoki yo'qligini aniqlashni maqsad qilgan.Ular ajdod bakteriyasining riboza operonini butunlay yo'q qildilar. Ular ko‘rganlari hayratlanarli edi: mutant bakteriyalar ajdodlariga qaraganda 2% tezroq ko‘paygan. Bunday foydali mutatsiya tez tarqalishi va tajribaning boshida paydo bo'lishi mumkin edi. Buni tekshirish uchun Lenski va uning hamkasblari tajribaning turli yillarida chuqur muzdan namunalar olib, gen versiyalarini izlashdi. Ular dastlabki 500 avlod davomida hujayralar ribozani hali ham hazm qila olishini aniqladilar, ammo 2000-avlodga kelib, 12 populyatsiyadan 11 tasida bu xususiyatni yo'qotgan allellar mavjud. Ushbu eksperimental tadqiqotlar transpozonlar foydali mutatsiyalarni yaratishi mumkinligini, foydali mutatsiyalar juda qisqa vaqt ichida tarqalishini va evolyutsion tanlovning umumiy bosimi shunga o'xshash fenotipik o'zgarishlarga olib kelishini eksperimental tarzda isbotlaydi. Agar siz so'rasangiz, nima uchun riboza operonini yo'q qilish foydali? Sizga kerak bo'lmagan tuzilma, organ yoki tizimni ko'chirish qimmatga tushadi. Zarur bo'lmagan organni ko'chirish evolyutsion iqtisod nuqtai nazaridan qimmatga tushganidek... Tajriba muhitida asosiy ozuqaviy material riboza emas, glyukoza edi. Lenski tajribasida bakteriya flagellumini tashkil etuvchi ba'zi genlar yo'qolganligi ko'rsatilgan. Tabiatda oziq-ovqat topish imkoniyatini oshiradigan bu tuzilmalar tayyor oziq-ovqat beriladigan tajriba muhiti sharoitida foydasizdir. Lenski tajribasi bizga nafaqat evolyutsion moslashuvlarning ajoyibligini, balki foydalanilmagan tuzilmalar atrofiyaga mahkum bo'lgan evolyutsion biologiya qonunini ham isbotladi.Bularning barchasidan ko'rinib turibdiki, evolyutsiyani amalga oshiradigan ko'plab mexanizmlar mavjud. Ammo tirik mavjudotlarni eng kichigidan tortib eng kattasiga qarasak, hamma joyda evolyutsiya izlarini ko'rishimiz mumkin. Ushbu qiziqarli gen parchalari bizga evolyutsiya haqida muhim ma'lumotlarni ham beradi.
Klonlash: Organizmning har qanday DNK mintaqasi boshqa hududlardan alohida ajratiladi va ifodalash uchun boshqa mintaqaga qo'shiladi. Vektorlar, aksincha, ajratilgan DNK bo'laklarini biriktiradigan va bu parchalarni olib yuradigan tizimlardir. Agar vektorni aniqlash kerak bo'lsa; Ular maxsus nukleotidlar ketma-ketligidan kesilgan DNK fragmentlarini retsipient hujayraga o'tkazishni ta'minlaydigan tuzilmalardir.
Vektor quyidagi xususiyatlarga ega bo'lishi kerak:
Qabul qiluvchi hujayraning o'z xromosomasidan mustaqil ravishda ko'payish qobiliyati. Demak, replikatsiyaning kelib chiqishi bo'lishi kerak. U boshqa hujayralar orasidan tanlanish qobiliyatini beradigan genni olib yurishi kerak. Bular antibiotiklarga qarshilik yoki metallga qarshilik kabi genlar bo'lishi mumkin.
U atrof-muhitdan alohida molekula sifatida ajratilishi kerak. Agar bu virus bo'lsa, u bakterial xromosomaga qo'shilmasligi kerak.
U bitta, o'ziga xos cheklovli endonukleaza bo'linish joyini o'z ichiga olishi kerak.
Bugungi kunda vektor tizimlari quyidagilardan iborat:
Plazmid vektorlari
virusli vektorlar
Ekspiratuar (shuttle) vektorlari
Ti plazmid
kosmid vektorlari
Yac vektor
PLAZMIDA VEKTORLAR. Plazmidlar xromosomadan tashqari ikki ipli tuzilmalar bo'lib, ular bakteriyalarda juda qisqa vaqt ichida va avtonom tarzda ko'paya oladi. Ular antibiotiklarga qarshilik genini o'zlarida olib yurishlari mumkin. Ular bir bakteriyadan boshqasiga o'tishi mumkin. Ularning o'lchami 7-9 kb bo'lib, turlarga xosdir. Bu xususiyatlarning barchasi tufayli ular vektor sifatida ishlatiladi. Markerga ega bo'lgan plazmid bilan klonlanadigan DNK (masalan, antibiotiklarga qarshilik) bir xil cheklovchi endonukleaza bilan kesilishi kerak. Ikkala strukturada ham bir-birini to'ldiruvchi yopishqoq uchlar paydo bo'ladi. Agar ikkita konstruktsiya bir xil muhitga joylashtirilsa va DNK ligaza bilan ishlov berilsa, rekombinant DNK molekulasi hosil bo'ladi. Bu noto'g'ri o'yinlar bo'lishi mumkin. Ushbu nomuvofiqliklar vektorda joylashgan marker mintaqasi bilan ajralib turadi. Gen muhandisligida qo'llaniladigan plazmidlar ma'lum miqdordagi kesilgan joylar va antibiotiklarga qarshilik genlarini o'z ichiga olgan holda o'zgartiriladi. Ba'zan plazmiddagi kesilgan joylar asalli joyda to'plangan. Bular polilinker mintaqalar deb ataladi. Masalan, pUC18da bu polilinker hudud Lac Z genida joylashgan.Agar klonlash muvaffaqiyatli bo'lsa, odatda ko'k rangli koloniyalarni hosil qiluvchi E.coli hujayralari oq rangli koloniyalarni hosil qila boshlaydi. Chunki LacZ geni ishlamay qolgan. Shunday qilib, rekombinant DNK ketma-ketligini tashuvchi hujayralarni boshqalardan osongina ajratish mumkin. Plazmid vektorlari virus vektorlariga qaraganda klonlangan DNK bilan ishlashni osonlashtiradi. VIRUSLI VEKTORLAR. Virusli vektorlarning eng katta xususiyati shundaki, plazmidlarda 3500bp gacha ko'tara oladigan plazmidlarga nisbatan kattaroq DNK fragmentlarini klonlash mumkin (taxminan 15-35 kb). Virusli vektorlar bilan ishlaganda, birinchi navbatda, ishlatiladigan virus genini xaritaga tushirish kerak. Shunday qilib, virusning hujayradan chiqishini ta'minlaydigan kapsid va yig'ilish kabi gen mintaqalarining joylari topiladi va olib tashlanadi. Virusning hujayradan chiqib ketishining oldini olishning o'zi etarli emas. Virusning bakteriyalarda lizogen fazaga o'tishiga sabab bo'lgan gen hududini ham olib tashlash kerak. Bu jarayonlardan keyin qolgan tuzilmaga nazar tashlasak; Virusda juda ko'p ko'payishi mumkin bo'lgan genlar mavjud, ammo bu virus hujayradan chiqa olmaydi. Virusning hujayrada ko'payishi uchun zarur bo'lgan genlar soni 1 bakteriofag uchun 35 kb ni tashkil qiladi. Shunday qilib, biz ushbu bakteriofag uchun ishlatadigan qism 15 kb.
L vektorda ikkita muhim mintaqa mavjud. Ulardan birinchisi klonlanadigan gen hududi joylashtiriladigan mintaqadagi cheklovchi endonukleaza kesilgan hudud, ikkinchisi esa vektorning har ikki uchida joylashgan “cos” deb ataladigan hududlardir. Bu uchlar DNK fragmentini vektor konvertiga kiritish uchun talab qilinadi. Klonlanadigan DNK cheklovchi endonukleaza yordamida kichik bo'laklarga bo'linadi. Vektor ham ushbu ferment bilan kesiladi, inson DNKsining istalgan qismi bilan birlashtiriladi va virus konvertiga kiritiladi. Keyinchalik bu v.ruslar E.coli ni yuqtirish uchun ishlatiladi. Bakterial madaniyat muhitida hosil bo'lgan har bir virus blyashka DNK fragmentlaridan faqat bittasini olib yuradi. Inson DNKsidan olib tashlanishi kerak bo'lgan maxsus DNK bo'lagidan hosil bo'lgan plastinka maxsus texnikalar yordamida boshqa plitalar orasidan osongina tanlanadi. Keyin uni xohlagancha ko'paytirish mumkin.
KOSMID VEKTORLARI
Kosmid vektorlari DNK molekulalari bo'lib, ularda virus vektori kabi cos mintaqasi va plazmid vektorlari kabi ori va antibiotiklarga qarshilik genlari mavjud. Shu tariqa rekombinant molekula I vektordagi kabi virus fragmentlariga kiritilishi mumkin, plazmid esa vektordagi kabi bakteriyalarda takrorlanishi va tanlanishi mumkin. Kosmid vektorlari taxminan 45 kb DNKni olib yurishi mumkin. Kosmid vektorlarining shakllanish bosqichlari:
1 cos mintaqasini o'z ichiga olgan plazmid BamHI kabi cheklovchi endonukleaza bilan kesiladi va shu bilan chiziqli bo'ladi.
Plazmidlarning tasnifi
Tabiiy plazmidlarning eng foydali tasnifi plazmid genlari tomonidan kodlangan belgilarga asoslanadi. Ushbu tasnifga ko'ra, plazmidlarning 5 turi mavjud.
1- Fertilite yoki 'F' plazmidlari faqat tra genlarini olib yuradi va plazmidlarning konjugal o'tkazilishini ta'minlash qobiliyatidan tashqari xususiyatga ega emas.
2- Qarshilik yoki "R" plazmidlari levomitsetin, ampitsillin va simob kabi bir yoki bir nechta agentlarga xos bakteriyalarga qarshilik ko'rsatadigan genlarni olib yuradi. R plazmidlari klinik mikrobiologiyada juda muhimdir, chunki ularning tabiiy populyatsiyada tarqalishi bakterial infektsiyalarni davolashda juda jiddiy salbiy ta'sir ko'rsatishi mumkin. Masalan, RP4 odatda Pseudomonasda uchraydi, lekin ko'plab bakteriyalarda ham uchraydi.
3- Col Plazmidlar kolozinlarni, boshqa bakteriyalarni o'ldiradigan oqsillarni kodlaydi, masalan, E.coli ning ColE1.
4- Buzuvchi plazmidlar mezbon bakteriyalarga toluol, salitsil kislotasi kabi g'ayrioddiy molekulalarni, masalan, Pseudomas TOLni metabolizatsiya qilish imkonini beradi.
5- Virulentlik Plazmidlar mezbon bakteriyalarga patogenlikni beradi. Bularga Agrobacterium tumefaciens ning Ti plazmidlari kiradi, ular ikki pallali o'simliklarda o't toj kasalligini keltirib chiqaradi.
Bakteriyalardan boshqa organizmlardagi plazmidlar
Plazmidlar bakteriyalarda keng tarqalgan bo'lsa-da, boshqa organizmlarda ular hech qachon keng tarqalgan emas. Eng yaxshi xarakterli eukaryotik plazmidning bir nechta shtammlaridan 2 mkm halqaning topilishi, xamirturush Saccharomyces cerevisia katta ahamiyatga ega, chunki u asosiy sanoat organizmi bo'lgan genlarni klonlash uchun vektorlarni yaratishga imkon beradi. Biroq, boshqa eukaryotlarda (masalan, filamentli suv o'tlari, o'simliklar va hayvonlar) plazmidlarni izlash umidsizlikdir va ko'plab yuqori organizmlarning hujayralarida plazmidlar yo'qligi shubhalanadi.
3-ma’ruza: Nuklein kislotalar tuzilishi xossalari va oqsil biosentezi
Reja
Nuklein kislotalar gibridizatsiyasi va uni amaliy ahamiyati. DNK ni o’z-o’zidan ikkilanishi.
Nuklein kislotalar molekulalarini amplifikatsiyasi va uni amaliyotda ishlatilishi
3. Nuklein kislotalar asosida nanokonstruksiyalar
yaratishga asosiy yondashish.
DNKga oʻxshab RNK ham nukleotidlardan iborat boʻlib, nukleotidlar oʻz navbatida 5-halqali riboza monosaxaridi, fosfat guruhi va azot asoslaridan tashkil topgan. Shunga qaramay, DNK va RNK oʻrtasida uchta asosiy farq bor:
RNKda dezoksiriboza emas, balki riboza boʻladi.
RNK ikki zanjirli emas, balki bir zanjirli boʻladi.
RNKda timin oʻrniga urasil boʻladi.
DNK – hayotni barcha hujayrali shakllarida irsiy axborotlarni tashishdek o‘ta mas’uliyatli vazifani bajaradi. Ikkinchidan, har xil turlarni DNK molekulalari, gibridizatsiya uchrash imkoniyatiga ega – har xil turlarining DNK zanjirini bo‘lakchalari yagona ikkizanjirli DNK molekulasiga yig‘ilishi mumkin.
Har xil turlarni DNK molekulalari, gibridizatsiya uchrash imkoniyatiga ega – har xil turlarining DNK zanjirini bo‘lakchalari yagona ikkizanjirli DNK molekulasiga yig‘ilishi mumkin.
DNK ni o‘z-o‘zidan ikkilanishi (autoreplikatsiya) deyiladi.
Autoreplikatsiyda maxsus topoizomeraza va xelikaza fermentlari DNK ni dastlabki ona molekulasini tarqatadilar va ikki polipeptid zanjirga ajratadilar. Ona DNK ni har bir zanjiri DNK polimeraza fermenti yordamida, DNK ni yangi zanjirini yig’ish uchun matritsa bo’lib xizmat qiladi.
Xelikaza zanjirni beqarorlashtiruvchi ferment sifatida ham tanilgan. Xelikaza DNKning ikkita ipini topoizomeraza orqasidagi replikatsiya vilkasida ajratadi. Helikazlar barcha tirik organizmlarda uchraydigan fermentlar sinfidir. Ular "molekulyar mashinalar" deb tasniflanadi, chunki ular nukleotid trifosfatlarning gidrolizlanish energiyasidan nuklein kislotalarning shakar-fosfat magistral bo'ylab harakatlanishi va asoslar o'rtasidagi ichki yoki molekulalararo vodorod aloqalarini buzish uchun foydalanadi.
DNK polimeraza DNK replikatsiyasi jarayonida nukleotid substratlarini DNKga 5' dan 3' yo'nalishda qo'shishni katalizlash uchun javob beradigan ferment. DNK polimerazasining ko'plab turlari mavjud bo'lib, ularning har biri har xil turdagi hujayralarda turli funktsiyalarni bajaradi.
DNK-polimerazani o‘ziga xos xususiyati shuki, u qiz DNK ni sintezini noldan boshlay olmaydi. DNK-polimeraza polinukleotid zanjirini 31-uchi bo‘sh bo‘lganda, ularga nukleotidlarni ulay oladi. Shuning uchun avval boshqa ferment-RNK-praymaza, RNK-zatravka quradi va undan keyingina, DNK-polimeraza qiz zanjirini uzaytiradi (o‘stiradi). Bunda bitta qiz zanjir (yetakchi) to‘xtovsiz sintez bo‘lib turadi. Boshqa qiz zanjir mayda fragmentlardan (Okazaki fragmentlaridan) yig‘iladi.
DNKni bitta qiz va bitta ona zanjiri ulanib, DNKni qiz molekulasini hosil qiladi.
Nihoyat, tuzilishi ona DNK dan farq qilmaydigan ikki zanjirli qiz molekulalar paydo bo‘ladi. Ularni har biri, dastlabki ona DNK molekulasining bir zanjiridan va bitta yangi sintez bo‘lgan qiz zanjiridan tashkil topgan bo‘ladi.
DNK molekulasining ikkinchi unikal xususiyati – gibridizatsiyalanish qobiliyati – uning strukturasini o‘ziga xosligiga asoslangan. Har xil turlar (organizmlar) DNK molekulasini alohida zanjirlari qo‘shilib, yagona ikkizanjirli DNK molekulasini hosil qilishiga gibridizatsiya deb ataladi.
In vitro (probirkada) sharoitidagi eksperimentlarda DNK ni alohida zanjirlari olingan. DNK molekulasini bufer eritmasida eritib 100 oC da qizdirilganda, komplementar asoslar orasidagi vodorod bog‘lari uziladi va DNK molekulasi ikki alohida polinukleotid zanjirga ajraladi. Bu jarayon DNK ni denaturatsiyasi (“erishi”) deb nom olgan.
Ikki har xil tipga mansub bo‘lgan DNK zanjirlarini arlashtirgandan keyin, eritmani sovutib, 65 oC da ushlab turilsa, zanjirlar boshqadan bir-birlari bilan qo‘shilib, ikkizanjirli DNK hosil qiladi. Ikkilamchi spiralni qaytarilishi (gibridizatsiyasi yoki bu jarayon “otjig” deb atalgan) sodir bo‘ladi. Bunda gibrid molekulalar (duplekslar) ham har bir dastlabki turga spetsifik bo‘lgan molekulalar hosil bo‘ladi.
Bir zanjirli DNK ni otjigining tezligini analiz qilish orqali, dastlabki DNK molekulalarini orasidagi farqni va o‘xshashlikni baholash mumkin. Mana shu usul asosida “DNK-DNK” tipidagi duplekslarni va “DNK-RNK” tipidagi birikmalarni shakllantirish mumkin.
Hozirgi vaqtda DNK gibridizatsiyasiquyidagi sohalarda ishlatilmoqa:
DNK da ma’lum nukleotid ketma-ketlikga ega bo‘lgan nukleotidlar (genlar) sonini topish uchun;
Hujayrada bitta genni (yagona genni) borligini yuqori aniqlikda ko‘rsatib berish uchun;
Hujayrada matritsa RNK sini alohida turlarini aniqlash uchun;
Murtak rivojlanishi davomida genlarni saylov faolligini o‘rganish uchun;
DNK da sanaladigan (transkripsiya bo‘ladigan) va sanalmaydigan (transkripsiya bo‘lmaydigan) nukleotidlarni ketma-ketligini aniqlash uchun;
DNK ni replikatsiyalanish va gibridizatsiyalanish imkoniyatlari asosida, olimlar DNK ni amplifikatsiya (ko‘p marotaba nusxalanish) usulini ishlab chiqishga erishdilar va bu usul amaliyotda keng ishlatilib kelinmoqda.
DNKni strukturasini aniqlash (nukleotid ketma-ketligini) biologiya, tibbiyot, qishloq xo‘jaligi, arxeologiya, paleontologiya, kriminalistikada kundan-kunga keng ishlatilib kelinmoqda. DNK strukturasini aniqlash maxsus laboratoriya usullari yordamida olib boriladi va tadqiqot obyekti sifatida bir organizmdan ajratib olingan katta miqdordagi DNKni talab qiladi.
DNK molekulasini nusxasini ko’paytirish amplifikatsiya deyiladi. Bu usul tufayli bir necha soat davomida molekulalarni (genlar, DNK bo‘laklari) millionlab nusxalarini olish imkoni tug‘ildi. Nusxalar soni ko‘paygandan keyin, ularni oddiy laboratoriya usullari yordamida o‘rganish osonlashadi.
Amplifikatsiyani amalga oshirish uchun qanday birlamchi (dastlabki) komponentlar tayyorlash kerakligini aniqlash. Bunday komponentlarga quyidagilar kiradi:
1). DNK – matritsa – DNK molekulasi yoki uning bir qismi (bu virus yoki bakteriyani atigi birgina DNK molekulasi bo‘lish mumkin);
2). Praymerlar (20-30 juft nukleotiddan tashkil topgan, unchalik kattalikga ega bo‘lmagan fragmentlar). Bu praymerlar o‘rganiladigan genni oxirida joylashgan nukleotidlar ketma –ketligiga komplementar bo‘lish kerak. Praymerlar ikki maqsadga xizmat qiladi: birinchidan, erkin 31-uchli ketma-ketlik taqdim qilib, DNK – polimerazani ishga tushirib yuboradi; ikkinchidan, fermentni DNK ni faqatgina nusxalanishga tanlangan qismi doirasidagina ishlashga majbur qiladi, ferment faoliyatini ikki tomondan chegaralab qo‘yadi;
3). DNK ni yangi komplementar zanjirini sintez qilish uchun material hisoblangan nukleotidlar aralashmasi;
4). DNK – polimeraza fermenti;
5). Bufer eritmalar (Mg2+, saqlagan reaksion muhit, bu muhit fermentni faolligini ushlab turish uchun kerak).
Polimeraza –zanjirli reaksiya bir-biriga o‘xshagan ko‘plab sikllar (qaytarishlar) ko‘rinishida o‘tadi. Har bir sikl 3 bosqichda o‘tadi.
1 – bosqich. DNK ni denaturatsiyasi (qo‘sh bog‘li spiralni, alohida polinukleotidlar zanjirlariga ajralishi). Bu jarayon 93-95 oC da 30-40 sekund davom etadi. Yuqori harorat ta’sirida azotli asoslar orasidagi vodorod bog‘lari uziladi va DNK zanjirlari bir-biridan ajraladi.
2 – bosqich. Praymerlarni bog‘lash (gibridizatsiya). Harorat pasaytiriladi va praymerlar o‘rganiladigan genlar chegarasidagi o‘ziga komplementar bo‘lgan DNK uchastkasi bilan bog‘lanadilar. Gibridizatsiya 20 dan 60 sekundgacha davom etadi.
3 – bosqich. DNK zanjirini sintezi. Bu jarayon DNK – polimeraza yordamida amalga oshadi. Bu ferment, zatravka sifatida praymerni 31-uchini ishlatadi. DNK – polimeraza doimo zanjirni 51 dan 31-uchga qarab tugab (cho‘zilib) boradi. DNK ni yangi zanjirini sintezi uchun material bo‘lib, eritmaga qo‘shiladigan nukleotidlar xizmat qiladilar. Bu jarayon 70 -72 oC da o‘tadi va 20-40 sekund davom etadi.
PZR ni 1-sikli-oxirida, eritmada 2 ta ikki zanjirli DNK fragmentlari hosil bo‘ladi. Ulardan har biri, 1 ta dastlabki zanjir va 1 ta yangi hosil bo‘lgan praymer bilan bog‘langan zanjirdan iborat bo‘ladi. Ikkinchi siklda amplifikatsiyani yuqorida aks ettirilgan 3- bosqichni barchasi qaytariladi. DNK zanjirini denaturatsiyasi amalga oshadi. Keyin to‘rtta zanjirni har biri yana praymerlar bilan o‘zaro munosabatga kirishadi va nihoyat qidiriladigan genga mos keladigan ikki tomondan chegaralangan fragment paydo bo‘ladi. Bu fragmentlar – amplikonlar deb atalgan. PZR ni 2-siklini oxirida 2 ta amplikon paydo bo‘ladi
PZR jarayoni zanjirli xarakteriga ega ekanligi bilan farq qiladi: sintez bo‘lgan amplikonlar, keyinchalik o‘zlari matritsa bo‘lib xizmat qiladi. Ularda nusxalanish jarayoni o‘tadi. Mana shuning uchun ham, har bir yangi siklda DNK nusxasini soni geometrik progressiya bo‘yicha oshib boradi
Bugungi kunda nuklein kislotalar asosida nanokonstruksiyalar yaratishni ikki yo‘nalishi shakllangan: “qadam va qadam” va “birdaniga hammasini” konstruksiya qilish. “Qadam va qadam” konstruksiya qilish – dastlabki DNK molekulasini yoki sintez qilingan polipeptidni ketma-ket modifikatsiya qilishga asoslangan. Bu usul 1982 yilda amerikalik olim N. Siman tomonidan nazariy asoslab berilgan. Konstruksiya yig‘ishni birinchi qadami “yopishqoq” uchga ega bo‘lgan DNK fragmentini olish. Ikkinchi qadam – DNK ni har xil fragmentlarini vodorod bog‘lari yordamida bir-biriga yopishtirib chiqish. DNK zanjirida nukleotidlarni ma’lum ketma-ketligini tanlash orqali molekulani “shoxlanish nuqtasini” yaratish mumkin. “Shoxlangan nuqta” DNKni krestsimon fazoviy strukturasini shakllantirish imkonini beradi.
Bugungi kunda nuklein kislotalar asosida nanokonstruksiyalar yaratishni ikki yo‘nalishi shakllangan: “qadam va qadam” va “birdaniga hammasini” konstruksiya qilish. “Qadam va qadam” konstruksiya qilish – dastlabki DNK molekulasini yoki sintez qilingan polipeptidni ketma-ket modifikatsiya qilishga asoslangan. Bu usul 1982 yilda amerikalik olim N. Siman tomonidan nazariy asoslab berilgan. Konstruksiya yig‘ishni birinchi qadami “yopishqoq” uchga ega bo‘lgan DNK fragmentini olish. Ikkinchi qadam – DNK ni har xil fragmentlarini vodorod bog‘lari yordamida bir-biriga yopishtirib chiqish. DNK zanjirida nukleotidlarni ma’lum ketma-ketligini tanlash orqali molekulani “shoxlanish nuqtasini” yaratish mumkin. “Shoxlangan nuqta” DNKni krestsimon fazoviy strukturasini shakllantirish imkonini beradi.
Transkripsiya – gen ekspressiyasidagi birinchi qadam. Bu jarayon davomida gendagi DNK ketma-ketligi RNKga koʻchiriladi.
Transkripsiya boshlanishidan oldin genning atrofidagi DNK qoʻsh spirali ochilishi kerak. DNKning ochilgan qismi transkripsion pufakcha deyiladi.
RNK polimeraza – DNKdan RNK transkripsiya qiluvchi ferment. RNK polimeraza andoza DNKdan foydalanib yangi RNK molekulasini sintezlaydi. Masalan, agar andozada G boʻlsa, RNK polimeraza yangi zanjirga S qoʻshadi.
RNK polimeraza yangi zanjirni doimo 5ʼ-3ʼ yoʻnalishida sintez qiladi. Bunda RNK nukleotidlari zanjirning 3ʼ oxiriga qoʻshilib boradi.
Bakteriyalar kabi oddiy tuzilishga ega boʻlgan organizmlarda ham RNK polimerazalari mavjud va bir necha subbirliklardan iborat yirik fermentlar hisoblanadi. Odamlar va boshqa eukariotlarda uch xil RNK polimerazalari mavjud: I, II va III. Ularning har biri maʼlum bir gen sinflarini transkripsiya qilishga ixtisoslashgan. Oʻsimlikar maʼlum turdagi kichik RNKlarni ishlab chiqarishda ishtirok etuvchi ikki xil: IV va V chi qoʻshimcha RNK polimerazalarga ham ega.
Transkripsiya – genning DNK ketma-ketligi nusxasining RNK molekulasiga koʻchirilishi jarayoni.
|
