|
1- mavzu: Amaliy seminar: Biotexnologiya haqida umumiy tushuncha. Eukariot va prokariot organizm hujayralarining bir-biridan farqi; Reja
|
| bet | 21/30 | | Sana | 21.05.2024 | | Hajmi | 5,71 Mb. | | #248935 |
Bog'liq mutaxasisilikka kirish5.2. Urug'larni tayyorlash
Biologik mahsulot ishlab chiqarish uchun mikroorganizmlarning shtammlari ampulalarda keladi, u erda ular toza madaniyat shaklida saqlanadi. Har bir madaniyatda ozuqaviy muhit, morfologik, fiziologik va boshqa xususiyatlar, ularni saqlash shartlari, etishtirish va saqlash muddati ko'rsatilgan pasport mavjud. Ekinlarni saqlash rejimi sovutish, muzlatish yoki suvsizlanishni o'z ichiga oladi; barcha holatlarda hujayra metabolizmi keskin kamayishi yoki butunlay to'xtatilishi kerak. Shtamm kulturalari saqlanadi: obusli agarda, minus 1-5 ° C haroratda; -20 ° C dan past haroratlarda muzlashadi (qayta eritish va muzlatish mumkin emas);
ampulalarda lyofilizatsiya qilingan, bir necha yil davomida saqlanadi.
Ko'p sut emizuvchi hujayralar madaniyati, shu jumladan inson hujayralari, 180 ° C haroratda maxsus muhitda cheksiz muzlatib turilishi mumkin.
Muayyan vaqtdan keyin har bir mikroorganizm va saqlash turiga xos bo'lgan madaniyat elakdan o'tkaziladi. Texnologik jarayon boshlanishidan oldin madaniyat steril sharoitda ozuqaviy muhitning maqbul tarkibi va o'sib boradigan rejim bilan targ'ib qilinadi, o'sayotgan bosqichning davomiyligi 24 soat.
5.3. Kultivatsiya
Mikroorganizmlarni etishtirish bosqichi eng murakkab va mas'uliyatli hisoblanadi.
Biomassaning o'sishi va o'stirilishi quyidagi shartlarni talab qiladi:
Urug'ning yashovchanligi;
• energiya manbai (issiqlik) mavjudligi;
• etarli miqdorda ozuqaviy muhit;
• hayot uchun zarur bo'lgan fizik-kimyoviy sharoitlar.
1950 yillarning boshidan beri emlash uchun poliomielit sut emizuvchi hujayralar madaniyatida, shu jumladan inson embrionining fibroblastlarida o'stirilgan. O'sha paytdan boshlab embrion fibroblastlari boshqa bir qator viruslarning ajralishi va ko'payishi, juda o'ziga xos oqsillarni (antijismlar, interferonlar) ishlab chiqarishda, saraton kasalligini o'rganish va antiviral kimyoviy terapiyada ajralmas bo'lib qoldi.
To'g'ridan-to'g'ri tana to'qimalaridan (embrion yoki yangi tug'ilgan to'qimalar) tayyorlangan madaniyatlarga birlamchi madaniyat deyiladi. Ko'pgina hollarda, boshlang'ich madaniyat hujayralari madaniyat idishidan uzatiladi va bir necha hafta yoki oy davomida ketma-ket ko'chirilishi mumkin bo'lgan ko'p sonli ikkinchi darajali madaniyatlarni etishtirish uchun ishlatiladi. Turli xil hujayralar turli xil ozuqa moddalariga, shuningdek, bitta yoki bir nechta protein o'sishi omillariga muhtoj.
Hujayra chiziqlari bitta progenitor hujayradan kelib chiqqan klonlarni ishlab chiqarish uchun ishlatilishi mumkin.
Biotexnologiyada mikroorganizmlarni yuzaki va chuqur etishtirish usullari qo'llaniladi.
Yuzaki o'stirish paytida (monolayerda) embrionning maydalangan to'qimasini tripsin bilan davolash orqali hujayrali suspenziya olinadi. Bunday suspenziyadagi hujayralar kulturaviy muhit bilan tomirning zich yuzasiga joylashib, tekislanadi va bo'linib, tomir yuzasida monolayer hosil qiladi. Ushbu o'stirish usulida odatda silindrsimon idishlar ishlatiladi, ular uzun o'qlari bo'ylab asta-sekin aylanadi. Hujayralar o'sishi va biomassaning hosil bo'lishi süspansiyonga hujayralar o'rnatiladigan va ko'payadigan inert sintetik polimerning mikroskopik granulalarini qo'shish orqali ko'payishi mumkin. Süspansiyon kulturalarini, aralashtirish bilan 1000 l hajmli idishlarda olish mumkin.
Buning asosiy sababi chuqur etishtirish usuli bo'lib, bu ozuqaviy muhitning butun hajmidan foydalanish imkoniyatini anglatadi.
Mikroorganizmlarning o'sishi va rivojlanishiga hujayralararo va hujayradan tashqari omillar ta'sir ko'rsatadi. Hujayra ichidagi omillarga quyidagilar kiradi: hujayra tuzilishi, metabolik mexanizmlar va irsiy xususiyatlar. Hujayradan tashqari (tashqi) omillar, ya'ni. hujayraning atrof-muhit sharoitlari biotexnologiyaning asosiy tartibga soluvchi omillari hisoblanadi.
Sanoat etishtirish va maqsadli mahsulotni tozalash ko'p bosqichli jarayonlardir. Fermentatsiyaning umumiy sxemasi sek. 8.
Jarayon madaniyat muhiti va uskunalarini tayyorlash va sterilizatsiya qilishdan boshlanadi. Dastlab, dastlabki madaniyat yetishtiriladi (5-10 ml), keyin u inkubatsiya qilinadi. chayqatilgan flakon (200-1000 ml), keyin urug 'uchun fermentatorga (10-100 l) va nihoyat sanoat fermentatoriga (1000-100000 l) beriladi. Fermentatsiya tugagandan so'ng, ajralib chiqqan mahsulot hujayralarda yoki madaniyat muhitida bo'ladi, lekin ikkala fraksiyada bir vaqtning o'zida emas, shuning uchun keyingi fraktsiyalar ushbu fraktsiyalardan biri bilan amalga oshiriladi.
Mikroorganizmlarni o'stirish mumkin:
• partiyadagi fermentatorda;
• quyma fermentatorda substrat qo'shilgan holda;
• uzluksiz madaniyatda
Birinchi holda, mikroorganizmlar fermentatsiya paytida yangi madaniyat muhitini qo'shmasdan steril sharoitlarda o'stiriladi. Vaqti-vaqti bilan fermentatsiya paytida kulturaviy muhit tarkibi, mikroorganizmlar (biomassa) kontsentratsiyasi, oqsil mahsuloti yoki metabolit miqdori o'sish fazasiga, uyali metabolizmga va ozuqa moddalarining mavjudligiga bog'liq.
O'sishning oltita asosiy bosqichlari mavjud (9-rasm):
lag fazasi (1);
tezlashtirish fazasi (2);
eksponensial yoki logarifmik faza (3);
sekinlashuv fazasi (4);
statsionar faza (5);
so'lib qolish fazasi (6).
Qoida tariqasida, steril kulturatsiya vositasini in'ektsiya qilgandan so'ng, hujayralar sonining birdan ko'payishi kuzatilmaydi. Kechikish davri deb ataladigan vaqt o'tishi bilan hujayralar yangi sharoitlarga (turli pH yoki ozuqa kontsentratsiyalari) moslashadi. Ortiqcha fazaning davomiyligi urug 'hujayralari statsionar davrda bo'lgan vaqtga va madaniyat o'sgan muhit yangi, yangi madaniyat muhitidan qancha farq qilishiga bog'liq. Agar kulturatsiya eksponensial fazada bo'lsa, unda ko'rsatilgan kechikish fazasi bo'lmasligi mumkin va inokulyatsiyadan so'ng hujayralar o'sishi boshlanadi.
Kechikish va eksponent fazalari o'rtasida qisqa muddat - tezlashuv fazasi mavjud bo'lib, hujayraning o'sish tezligi doimiy qiymatga erishilguncha oshadi. Ekspansional bosqichda hujayralar bir nechta bo'linishlardan o'tadi. Substrat haddan tashqari ko'p bo'lganda, ekspansional fazada madaniyatning maksimal o'sish sur'ati erishiladi, ekspansional fazaning oxirida ko'plab hujayralar mavjudligi sababli, substrat juda tez iste'mol qilinadi va sekinlashuv fazasi paydo bo'ladi, bu esa qisqa umr ko'rishi mumkin. Cheklov osti qatlamining kamayishi yoki o'sishni sekinlashtiradigan metabolik mahsulotlarning to'planishi natijasida hujayralar sonining ko'payishi asta-sekin to'xtaydi va madaniyat statsionar bosqichga o'tadi.
Bu vaqtda biomassa doimiy bo'lib qoladi, metabolizm tubdan o'zgaradi, tijoriy qiziqishdagi birikmalar (ikkinchi darajali metabolitlar), masalan, antibiotiklar sintezlanadi. Statsionar fazaning davomiyligi ma'lum mikroorganizm va o'sish sharoitlariga bog'liq. Binoni bosqichida metabolizm to'xtaydi, chunki hujayralarning energiya zaxiralari tugaydi. Sanoat sintezida, o'lish fazasi boshlanishidan oldin ham, fermentatsiya to'xtatiladi.
Substrat qo'shilishi bilan davriy madaniyat fermentatorga ko'payib borayotgan ozuqa moddalarini vaqti-vaqti bilan kiritishni o'z ichiga oladi. Bunday holda, madaniyat vositasi jarayon oxirigacha chiqarilmaydi. Substratni davriy qo'shilishi ekspansional va statsionar fazalarning kengayishiga, biomassaning ko'payishiga va statsionar faza davomida sintezlangan metabolitlar soniga olib keladi. Rekombinant oqsilning uzluksiz sintezi va uning barqarorligini ta'minlash uchun jarayonni diqqat bilan nazorat qilish va substrat (uglerod, azot, vitaminlar, iz elementlari va boshqa biologik faol moddalar manbai) kerak bo'lgandan keyin zarur.
Mikroorganizmning genotipiga va rekombinatsiya qilinadigan oqsilning xususiyatiga qarab, substrat qo'shilgan fermentatsiya oddiy mahsulot fermentatsiyasiga qaraganda 25-1000% ga oshishi mumkin.
Substrat qo'shilgan fermentatsiya sutemizuvchi va hasharotlar hujayralarini etishtirish uchun ham ishlatiladi; ushbu madaniyatlar tibbiy ahamiyatga ega protein mahsulotlarini olish uchun keng qo'llaniladi, bundan tashqari, davriy substratni qo'shmasdan sutemizuvchi hujayralar xorijiy oqsillarni samarasiz sintez qiladi. Partiya fermentatsiyasi hujayralarni to'plash vaqtidagi kichik farqlar bilan tavsiflanadi, bu ekspansional fazaning o'rtasidan boshlab va uning kech bosqichi bilan yakunlanadi.
Ammo statsionar fazada mikroorganizmlar ko'pincha proteolitik fermentlarni - ishlab chiqarilgan oqsillarni yo'q qiladigan proteinazalarni sintez qilishadi; agar fermentatsiyaning maqsadi protein mahsulotlarini olish bo'lsa, siz statsionar fazaga kirishdan oldin jarayonni to'xtatishingiz kerak. Substratning keyingi qismini qo'shish vaqtini aniqlashda uning iste'moli bilan bog'liq bo'lgan ko'rsatkichlar qo'llaniladi: sintez qilingan organik kislotalar miqdori, pH qiymati yoki hosil bo'lgan CO2 miqdori. Yakuniy mahsulot jarayon oxirida yig'iladi.
Uzluksiz fermentatsiya paytida yangi kulturatsiya vositasi fermentatorga doimiy ravishda kiradi, shu bilan bir xil hajmdagi hujayrali suspenziya parallel ravishda chiqariladi. Shunday qilib, hujayralar sonining kamayishi (mahsulotni olib tashlash) bo'linish natijasida ularning ko'payishi bilan muvozanatlanadi. Shu bilan birga, kulturaviy muhitning oqim tezligi va bioreaktordagi doimiy madaniyat hajmi qat'iy nazorat qilinadi.
Ta'kidlash joizki, sanoat maqsadlarida doimiy fermentatsiya kamroq ishlatiladi, ammo doimiy fermentatorda ma'lum miqdordagi biomassani olish xarajati ommaviy rejimda ishlaydigan bioreaktorga qaraganda ancha past bo'ladi. Xarajatlarni pasaytirish quyidagilarga bog'liq:
- doimiy fermentatsiya uchun hujayralarni to'plash, ularni yo'q qilish va keyin mikroorganizmlar sintez qilgan protein mahsuloti yoki metabolitni tozalash uchun kamroq katta bioreaktorlar va uskunalar talab qilinadi;
Vaqti-vaqti bilan ta'sir etuvchi bioreaktor yuklanmoqda, qayta ishlatishga tayyorlanmoqda (bioreaktorni ta'mirlash, tozalash, sterillash jarayoni jarayon samaradorligini pasaytirishning asosiy sababidir); uzluksiz rejimda ishlaydigan fermentator uchun, to'xtash vaqti sezilarli darajada kam;
doimiy fermentatsiya bilan maqsadli mahsulot sintezi yanada izchil tarzda sodir bo'ladi, chunki ko'p hujayralarning fiziologik holati bir xil.
Uzluksiz fermentatsiya bir hujayrali mikroorganizmlar va antibiotiklar oqsillarini sanoat ishlab chiqarishda qo'llaniladi, ammo mikroorganizmlarni ko'paytirishning bu usuli muayyan qiyinchiliklar bilan bog'liq.
• doimiy fermantasyon davomiyligi ba'zan 500-1000 soatni tashkil qiladi, bu vaqt davomida ba'zi hujayralar rekombinant plazmidlarni yo'qotishi mumkin (ma'lumki, plazmidlarni tashimaydigan hujayralar kamroq energiya sarflaydi, tezroq bo'linadi, shuning uchun vaqt o'tishi bilan maqsadli mahsulotning hosildorligi pasayishi mumkin). - uni sintez qilishga qodir hujayralar sonini kamaytirish uchun);
• sanoat korxonalarida steril sharoitlarni uzoq vaqt saqlash qiyin;
• Uzluksiz jarayonlar steril zaxira uskunalarini talab qiladi, bu esa asosiy xarajatlarni sezilarli darajada oshiradi.
Yuqori zichlikdagi ekinlar. Madaniyatning maksimal yakuniy zichligida maqsad qilingan mahsulotning maksimal miqdori olinadi. Substrat qo'shilgan fermentantlarda rekombinant E. coli hujayralarining kontsentratsiyasi 1 litr ozuqaviy muhit uchun 50 g quruq moddaga etadi (ba'zi hollarda 100 g / l dan ortiq). Madaniyat zichligini oshirishning bir usuli - madaniyat muhitini optimallashtiris
Shuni yodda tutish kerakki, yuqori konsentratsiyadagi ba'zi oziq moddalar (shu jumladan uglerod, azot manbalari) hujayralar o'sishini sekinlashtiradi. Shunday qilib, glyukoza 50 g / l dan ortiq konsentratsiyada, ammiak - 3 g / l dan ortiq konsentratsiyada o'sishni inhibe qiladi; temir, magniy, fosfor, rux, mos ravishda - 1,15 g / l dan ko'p, 8,7 g / l, 10 g / l, 0,038 g / l.
Shunday qilib, ommaviy fermentatsiya paytida madaniyat muhitidagi ozuqaviy tarkibning oddiy ko'payishi kerakli natijani bermaydi.
Yuqori zichlikli kulturalarda kislorod etishmasligini oldini olish uchun kiruvchi tarqaladigan havo miqdori va aralashtirish tezligi oshadi. Havoni (20% kislorodni o'z ichiga olgan) emas, balki toza kislorodni madaniyatga etkazib berish yoki kislorodning eruvchanligini oshirish uchun ma'lum bir bosim ostida hujayralarni ko'paytirish mumkin. Madaniyatning yuqori zichlikdagi o'sishiga substrat qo'shilishi bilan davriy rejimda erishish mumkin. Oziq moddalarni etkazib berish rejimi quyidagicha bo'lishi mumkin: doimiy, bosqichli, eksponent. Uzluksiz sharoitda, fermentatsiya davomida madaniyat muhitiga teng miqdorda ozuqalar kiritiladi. Bosqichli rejimda hujayralar kontsentratsiyasi oshgani sayin, ko'payib borayotgan ozuqa moddalari qo'shiladi. Eksponensial rejimda ozuqa moddalari hujayraning doimiy o'sishini ta'minlaydigan miqdorda qo'shiladi. Fermentatsiya paytida ozuqa moddalarini davriy etkazib berish kulturaviy muhitning cheklangan substratining (masalan, glyukoza) kontsentratsiyasini o'lchash natijalari asosida avtomatlashtiriladi.
Keng ko'lamli fermentatsiya bilan yana bir jihatni ko'rib chiqish kerak. Rekombinant mikroorganizmlarning atrof-muhitga tasodifiy chiqishini oldini olish muhimdir; Buning uchun tirik rekombinatsiya qiluvchi organizmlarning oqishini oldini olish yoki ularning tarqalishini cheklash uchun ishonchli tizimlardan foydalaniladi. O'rnatishdan to'liq chiqarib olishdan oldin, barcha rekombinant mikroorganizmlar ma'lum ko'rsatmalarga muvofiq faollashtirilishi kerak. Ishlatilgan kulturatsiya vositasi atrof muhitga chiqarilishining oldini olish uchun unda yashovchan mikroorganizmlar mavjudligi yaxshilab tekshiriladi.
|
|
Bosh sahifa
Aloqalar
Bosh sahifa
1- mavzu: Amaliy seminar: Biotexnologiya haqida umumiy tushuncha. Eukariot va prokariot organizm hujayralarining bir-biridan farqi; Reja
|
