|
1- mavzu: Amaliy seminar: Biotexnologiya haqida umumiy tushuncha. Eukariot va prokariot organizm hujayralarining bir-biridan farqi; Reja
|
| bet | 24/30 | | Sana | 21.05.2024 | | Hajmi | 5,71 Mb. | | #248935 |
Bog'liq mutaxasisilikka kirish5.6. Kultivatsiya paytida biomassa va hujayra sonini boshqarish usullari. Apoptoz va hujayra nekrozi
Biomassa deganda ekish paytida mikroorganizmlar yoki hujayralarning qattiq yoki suyuq ozuqaviy muhitdagi jami konsentratsiyasi tushuniladi. Biomassani boshqarishning eng nozik usuli bu mikroskop yordamida chiziqli o'lchamlarni yoki yashovchan hujayralar sonini (binoni usuli) aniqlash bilan hujayralarni hisoblash. Biomassadagi hujayralar sonini, shuningdek, santrifuga krujkalaridagi cho'kindi miqdori bilan boshqarish mumkin.
Bilvosita usullar nafas olish tezligini (infraqizil gaz analizatori tomonidan CO2 kontsentratsiyasining o'zgarishi) yoki oqsil tarkibini aniqlash uchun bilvosita usullardan ham foydalaniladi (eng sezgir usul bromosulfaleinni oqsilning asosiy guruhlariga bog'lash asosida bromosulfalein sinovidir). Mikroorganizmlar va hujayralar sonini fizik-kimyoviy usullar bilan aniqlash mumkin: o'tkazuvchanometrik (elektr o'tkazuvchanligi bo'yicha), spektrofotometrik, kolorimetrik, nefelometrik.
Hujayra o'limi filtrlarni va namunalarni ifloslantiruvchi hujayra parchalarini, hujayra ichidagi fermentlarni chiqarilishiga olib keladi. Hujayra o'limiikki mexanizm orqali amalga oshiriladi: apoptoz va nekroz.
To'liq hayotiy hujayralar o'lib ketishi mumkin, ya'ni. Hali o'zlarining hayotiy manbalarini tugatolmaganlar. Ko'pincha hujayraning o'zining o'limida faol rol o'ynaydi - tarkibidagi mexanizmlar yordamida hujayradan tashqari yoki hujayra ichidagi muhitning ba'zi omillari qo'zg'atiladi; natijada apoptoz yoki dasturlash tirilgan hujayrali o'lim haqida fikr paydo bo'ldi. Apoptoz dasturlashtirilgan hujayra o'limi deb ta'riflanadi, bu hujayralar o'limini anglatadi, uning rivojlanishida maxsus va genetik dasturlashtirilgan hujayra ichidagi mexanizmlar faol rol o'ynaydi.
"Apoptoz" so'zining asl ma'nosi juda poetikdir, yunon tilida bu barglarning tushishini anglatadi.
Hujayrada apoptoz dasturi faollashtirilgan holatlar doiras ijuda keng, ularni ikki guruhga bo'lish mumkin:
- hujayraning ichida napoptozni keltirib chiqaradigan "qoniqarsiz" holati;
- maxsus hujayrali retseptorlari orqali uzatiladigan "salbiy" signal ("buyruqbo'yichaapoptoz").
Xromosoma va hujayra ichidagi membranalarga jiddiy zarar etkazilishi hujayraning o'zi "qoniqarsiz" holatni ko'rsatishi mumkin. Shu ma'noda, apoptoz nuqsonli hujayralarni o'ldirish funktsiyasini bajaradi. Apoptozning eng muhim vositasi - bu sitoplazmatik proteazlar, yadroviy endonukleazlar, ikkinchisi DNKni nukleotidlarga emas, balki ko'proq yoki kamroq katta bo'laklarga parchalaydi.Apoptozning boshqa "vositalariga" kuchli oksidlovchi moddalar birikmasi kiradi - bu nafaqat azot oksidi, balki boshqa reaktiv moddalar - superoksid va gidroksid radikallari, peroksinitrit, nitritlar, nitratlar va boshqalar. Oddiy hujayrada radikallar va oksidlovchi moddalardan himoya qilish mexanizmlari mavjudligi ma'lum. Bular antioksidant tizimning fermentlari: superoksid dismutaza (superoksidni vodorod peroksidiga aylantiradi), katalaz va peroksidaz, vodorod peroksidini muhitdan yo'q qiladi. Haroratning o'zgarishi, to'yib ovqatlanmaslik natijasida hujayralarga zarar etkazilishi mumkin. Agar hujayraga etkazilgan zarar haddan tashqari bo'lsa, uning o'limi jarayoni nazorat qilib bo'lmaydi - bu nekroz.
Shunday qilib, zararli ta'sirlarning intensivligi va tabiatiga qarab, hujayralar o'limi ham apoptotik, ham nekrotik bo'lishi mumkin.
5.7. Biosintez mahsulotlarini izolyatsiya qilish
Texnologik jarayonning ushbu bosqichining umumiy sxemasi sek. 12. Agar mahsulot hujayralar ichida lokalizatsiya qilingan bo'lsa, ular yo'q qilinadi, hujayra qoldiqlari chiqariladi va mahsulotlar tozalangan muhitdan ajratiladi; sekretsiya mahsuloti to'g'ridan-to'g'ri muhitdan ajratiladi.
Bo'linuvchilar, cho'kindi santrifugalari, filtr presslari, vakuumli baraban filtrlari, qaytib vakuum filtrlari va quyma rezervuarlari hujayra biomassasini yoki madaniyat suyuqligini ajratish uchun ishlatiladi. Uskunani tanlash etishtirish ko'lamiga, hujayralar turiga, kulturatsiya suyuqligining xususiyatlariga bog'liq.
Tegishli yarim doimiy tsentrifugalardan foydalangan holda yuqori tezlikda santrifugatsiya hujayralarni katta hajmdagi madaniyat muhitidan (sanoat miqyosida) ajratish uchun ishlatiladi. Hujayra suspenziyasi doimiy ravishda santrifüj barabaniga kiritiladi, hujayralar unda to'planib, tozalangan suyuqlik chiqariladi. Baraban cho'kindi hujayralar bilan to'ldirilganda, tsentrifuga to'xtatiladi va hujayralar yig'ib olinadi. Ushbu usulning noqulayligi bu jarayonni to'xtatish zarurati, mikroorganizmlarning atrof-muhitga tarqalishi ehtimoli, hujayralarni atrof-muhitdan butunlay olib tashlashning mumkin emasligi.
Madaniyat muhitidan hujayralarni ajratishning alternativ usuli membranani filtrlash orqali amalga oshiriladi. Ammo filtr yuzasida hujayralar to'planishi tufayli filtrlash jarayoni tezda sekinlashadi. Filtrlangan muhitning bosimining oshishi vaqtincha samarani beradi, chunki hujayralar teshiklarni yopib, kamroq o'tkazuvchan qatlam hosil qiladi.
Hujayralarning yo'q qilinishi (parchalanishi). Buning uchun turli xil kimyoviy, biologik, fizik usullarni qo'llang. Barcha protseduralar bir vaqtning o'zida hujayra devorini yo'q qilish uchun etarli darajada qattiq bo'lishi kerak va oqsil (yakuniy mahsulot tarkibidagi o'zgarishlar) istisno qilish uchun yumshoq bo'lishi kerak.
Mikroorganizmlarning hujayra devorlari turli xil polimerlardan iborat, shuning uchun ularni yo'q qilishning universal usuli yo'q.
Gram-musbat mikroorganizmlarda hujayra devoripeptid ko'priklar ibilan bog'langan N-asetil glukoza minva N-atsetil muramik kislota qoldiqlaridan iborat qalin peptid oglikan qatlamidan iborat.
Gram-salbiy bakteriyalarda hujayra devori yupqaroq va tashqitomondan lipidlar qatlami bilan qoplangan.
Xamirturush hujayralarining devori qisman fosforitlangan mannatlar va P-glyukanlarning zich qatlamidan iborat. Pastki zamburug'lar a- va P-glyukanlar, glikoproteinlar va xitindan tashkil topgan ko'p qatlamli hujayrali devorlarga ega. Hujayra devorining tarkibi va kuchi etishtirish sharoitlariga, hujayralarning o'sish tezligiga, ular to'plangan fazaga, kontsentrlangan hujayralarni saqlash sharoitlariga va izolyatsiya qilingan mikroorganizmning klonlangan gen bilan bog'liqligiga bog'liq.
Hujayra devorlarini yo'q qilishning kimyoviy usuli ishqor bilan ishlov berishdir. Agar protein mahsuloti 10,5 dan 12,5 gacha pH darajasida parchalanmasa, ko'p miqdordagi bakterial hujayralarni osongina bo'yash mumkin. Masalan, insonning rekombinatsion o'sishi gormoni pH 11 da natriy bikarbonat bilan ishlov berish orqali E. coli hujayralaridan ajratib olish juda oson, ishqoriy bilan davolangandan so'ng deyarli hayotiy hujayralar qolmaydi, bu avtomatik ravishda rekombinat mikroorganizmlarning oqishi muammosini hal qiladi. Mikroorganizm hujayralarini yo'q qilishning asosiy biokimyoviy usuli bu fermentlar yordamida lizizdir. Shunday qilib, tuxum oq lizozim gram-musbat bakteriyalarning hujayra devorlarini osonlikcha gidroliz qiladi. Gram-salbiy bakteriyalarning hujayralarini yo'q qilish uchun lizozim va EDTA ishlatiladi. Xamirturush va mog'orlarning hujayra devorlari bir yoki bir nechta fermentlar bilan gidrolizlanadi: fosfanamaza, [B-1,3- va B-1,6-glyukanaza, chitinaza yoki murakkab xamirturush tayyorlash. Enzimatik ishlov berish juda o'ziga xosdir va engil sharoitlarda liziz paydo bo'ladi.
Hujayralarni fizik usullar bilan yo'q qilish mumkin: mexanik bo'lmagan (osmotik zarba yoki tez-tez takrorlanadigan muzlash-eritish), mexanik (ultratovush bilan ishlov berish, ta'sir qilish, bosim ostida gomogenizatsiya). Mexanik ishdan chiqish, ayniqsa yuqori chastotali tovush to'lqinlarini keltirib chiqaradigan ultrasonik emitentlar bilan juda samarali. Ultrasonik parchalanuvchilar ultrasonik to'lqinlarning tranzistor generatoridan, piezoelektrik yoki magnitostritsiv transduserdan, ishchi kameralar to'plamidan (ultratovushli dispersiyaga asoslangan apparatlardan iborat UZDN-1, Rossiya). Katta miqdordagi hujayralar bilan ballistik parchalanish qo'llaniladi, u yuqori tezlikda to'p tegirmonlarida amalga oshiriladi, bu erda konsentrlangan hujayrali süspansiyon joylashtiriladi. Tegirmon xonasi inert abraziv material bilan to'ldirilgan (shisha, diametri 1 mm bo'lgan polimer sharlar). Tarkibi tezda eksa ustiga o'rnatilgan pichoqlar bilan aralashtiriladi. Aksariyat hujayralar to'plarning bir-biriga, pichoqlarning yuzasiga va kameraga nisbatan tezkor harakatlanishi natijasida yuzaga keladigan keskin stresslar tufayli yo'q qilinadi. Optimal hujayralarni yo'q qilish uchun sharoitlar pichoqlarning soni va shakli, aralashtirish tezligi, to'plarning soni va o'lchamlari, xonaning geometriyasi, harorat va hujayralar kontsentratsiyasining o'zgarishi bilan tanlanadi (kompaniyaning apparatlari "Uil A. Baxxotem, Shveytsariya, (Gifford Vud Co., AQSh). Ta'sir - yuqori yopishqoqlikdagi hujayrali süspansiyon bosim ostida sobit yuzaga yo'naltiriladi, aloqa joyida hujayralarni yo'q qiladigan katta miqdordagi energiya yo'q qilinadi. To'qnashuv usuli bilan hujayralarni yo'q qilish paytida hujayrali oqsillarning faolligi biroz pasayadi.
Ekstruziya usullari (hujayra süspansiyonunu kapillyar teshiklar orqali majburlash) suyuq yoki muzlatilgan hujayrali süspansiyonları qayta ishlash uchun mo'ljallangan. Ishlaydigan matrislarning teshiklarining diametri bir necha millimetrdan o'ndan o'ntagacha. Gidroeksiya ishchilarida bosim 2000-4000 kg / sm2 ga, qattiq fazali ishchilarda esa 10000-50000 kg / sm2 ga etadi. Ekstrüzyondan keyin bosim keskin pasayadi, bu hujayralar lizisini keltirib chiqaradi. Ekstruzion dezinfektsiyalash vositalari "Canon Gaulin" (AQSh), LKV (Shvetsiya) firmasi tomonidan ishlab chiqariladi.
Keyinchalik qayta ishlash. Hujayralar vayron qilinganidan so'ng, ularning qismlari past tezlikda santrifugatsiya yoki membrana orqali mikrofiltratsiya orqali chiqariladi. Protein mahsuloti lizatdan tuzlash usuli bilan ajralib turadi - neytral tuzlarning yuqori konsentratsiyalangan eritmalari, ko'pincha natriy yoki ammoniy sulfat bilan yog'ingarchilik orqali. Proteinni cho'ktirishga organik erituvchilar (etanol, aseton) yordamida erishish mumkin.
|
|
Bosh sahifa
Aloqalar
Bosh sahifa
1- mavzu: Amaliy seminar: Biotexnologiya haqida umumiy tushuncha. Eukariot va prokariot organizm hujayralarining bir-biridan farqi; Reja
|
