Del II Biologi
Anne har nylig mistet mannen sin i en ulykke og er svært deprimert. Hos fastlegen får hun resept på Vival® tabletter (diazepam). Hun synes ikke tablettene hjelper, og av bedriftslegen på jobben får hun resept på sovetabletter. Hun henter sovetablettene på sitt vanlige apotek. På esken står det Apodorm® (nitrazepam).
Om kvelden tar hun et par sovetabletter, og om natten sover hun for første gang på lenge flere timer i strekk. Neste morgen føler hun seg i dårlig form, men drar på arbeid likevel. I bilen sovner hun bak rattet og kjører utfor veien. Bilen kolliderer med et tre. Anne blir brakt til sykehus med brukket lårbein og oppskrubbet og oppkuttet ansikt.
Diazepam (Fig 1) utsettes for oksidativ metabolisme i Annes kropp, spesielt via N-demetylering.
Fig 1: Kjemisk struktur av diazepam.
Oksidativ metabolisme av diazepam via enzymene CYP2C18 og CYP2C19 har blitt sammenlignet in vitro i laboratorieksperimenter. Forsøksoppsettet var som følger:
- Mengde CYP-enzym (enten CYP2C18 eller CYP2C19) var 10 pmol
- Diazepam i konsentrajoner fra 5-200 µM ble løst i 250 µL buffer (pH 7,4) som inneholdt blant annet 1 mM NADPH
- Etter 15 minutters inkubasjon ble produsert mengde av N-demetyldiazepam målt ved ulike diazepamkonsentrasjoner tilsatt til enten CYP2C18 eller CYP2C19
- Km- og Vmax-verdier ble beregnet
I tabell 1 er kalkulerte verdier for Km og Vmax for N-demetylering via CYP2C18 og CYP2C19 oppgitt.
Tabell 1: Kalkulerte verdier for Km og Vmax.
CYP2C18
|
|
Vmax (min-1)
|
1.11
|
Km (µM)
|
24
|
Vmax/KM (min-1 µM-1)
|
0.047
|
CYP2C19
|
|
Vmax (min-1)
|
1.76
|
Km (µM)
|
21
|
Vmax/KM (min-1 µM-1)
|
0.084
|
a) Hva skyldes forskjellene i Vmax-verdier?
Vmax = kcat * [Etot] Etot = total enzymmengde.
Ettersom samme mengde enzym har blitt tilsatt både av CYP2C18 og CYP2C19, må forskjellene i Vmax-verdier skyldes ulik kcat (også kalt k2).
kcat er hastighetskonstanten for omdannelse av ES-komplekset til metabolitt/produkt, og er et mål for hvor raskt enzymet ”jobber” (omdanner substrat til produkt).
En høyere Vmax for diazepam til 2C19 innebærer derfor at aktiveringsenergien for ES -> EP er mindre når diazepam er bundet til 2C19 enn 2C18.
b) Km-verdiene for CYP2C18 og CYP2C19 er relativt like. Hva betyr det?
Det betyr at diazepam har ca. lik affinitet til 2C18 og 2C19, dvs. dannelse av enzym-substrat (ES)-komplekset (frå Substrat S og Enzym E i ”frie former”) per tid er den samme for 2C18 og 2C19.
I den samme artikkelen ble det også testet ut hvor høyt innhold det er av CYP2C18 og CYP2C19 i leverprøver/biopsier fra seks ulike personer (resultater vist i Tabell 2).
Tabell 2: Innhold av CYP2C18 og CYP2C19 (målt som pmol enzym per mg levervev) i leverprøver fra 6 ulike personer
Person nr.
|
CYP2C18
|
CYP2C19
|
1
|
1.3
|
31
|
2
|
1.9
|
30
|
3
|
2.1
|
29
|
4
|
1.7
|
Ikke målbar
|
5
|
1.1
|
67
|
6
|
2.2
|
67
|
c) Hvilken betydning vil de to enzymene normalt ha i forhold til hverandre i metabolismen av diazepam in vivo (i kroppen)?
Enzymmengden av 2C19 ser normalt ut til å være ca 15-30 ganger høyere enn 2C18 i human lever. Vi vet også frå informasjon til spørsmål a) at Vmax, og dermed Kcat, er høyere for 2C19 enn for 2C18. Ergo vil metabolismehastighet via 2C19 være mange ganger større enn via 2C18, og 2C19 vil derfor normalt ha en større betydning for metabolisme av diazepam i kroppen.
(Enkelte personer, dvs. ca. 2-3 % blant hvite og opptil 20 % blant asiatere, har imidlertid defekt 2C19-uttrykk (ikke kjent for studentene). Person nr. 4 er sannsynligvis en av disse. I slike tilfeller vil 2C18 kunne spille en viktig rolle i N-demetylering av diazepam.).
Anne får urinveisinfeksjon etter å ha sittet nedkjølt i bilvraket i 2 timer før brannmann-skapene får henne løs. Hun behandles med Bactrim (sulfametoksasol + trimetoprim).
d) Beskriv KORT mekanismen i bakteriecellene som sulfametoksasol virker på.
Sulfametoksasol er et antibiotikum i klassen Sulfonamider, og er en type vekstfaktor-analog. Stoffet er, som alle sulfonamider, strukturanaloger av p-aminobensosyre (PABA). PABA tas opp av bakterier og benyttes som substrat for syntese av Tetrahydrofolat (folsyre, THF) som er en essensiell kofaktor og forløpermolekyl ved DNA-syntese. PABA utgjør således en del av THF-molekylet. Sulfonamider, som strukturanalog av PABA, blokkerer syntesen av THF, slik at bakteriene vil mangle en essensiell kofaktor for DNA-syntese, og kan ikke lenger replikere sitt DNA. Resultat: vekstinhibering (bakteriostatisk dersom benyttet alene).
På sykehuset tar man en prøve og isolerer bakterien som forårsaker Annes urinveisinfeksjon.
e) Beskriv hvordan man kan gå frem for å undersøke bakterieisolatets følsomhet for sulfametoksasol.
Mikroorganismers følsomhet overfor antimikrobielle midler kan gjøres på flere måter. En vanlig, enkel prosedyre benytter agardiffusjonsmetoden, hvor en petriskål med et fast næringsmedium benyttes. Man sår ut (inokulerer) testorganismen på overflaten av mediet. Når hele overflaten er omhyggelig fuktet (ingen bare flekker!), fjernes væskeoveskuddet. La skålen stå i 15 min med lokket lagt løst på inntil overflaten er helt tørr.
Ved inokulering skal det dannes et jevnt teppe av vekst av tettstående, tildels sammenvokste enkeltkolonier som kommer tilsyne etter inkubering.
Det antimikrobielle middelet diffunderer utover i agaren fra sine reservoarer, enten fra lapper impregnert med et antimikrobielt middel, eller ved å lage brønner i næringsmediet som fylles med løsninger av det antimikrobielle middelet. La skålen stå ved værelsestemperatur i 30 minutter før den settes til inkubering med bunnen opp, ved 37oC til neste dag (ca. 20 timer). Konsentrasjonen av antimikrobielt middel i agaren er høyest tett inntil reservoarene og avtar gradvis med avstanden fra dem. Resultatet blir at veksten hemmes i soner rundt reservoarene, og hemningssonenes diametre avhenger av mikroorganismens følsomhet.
I en kontroll uten antimikrobielt middel, vil veksten være uhemmet.
Mønsteret av vekst/ veksthemming registreres.
(Veksthemming dvs. bakteriostase er ikke ensbetydende med bakteriedrap. Tar man prøver fra områdene uten vekst, viser det seg ofte at bakteriene ikke er drept ved de lavere konsentrasjonene. Ofte kan det også bli synlige enkeltkolonier innenfor hemningssonen. Det skyldes oppvekst fra enkelte resistente kloner av organismen.)
I ansiktet har Anne flere blåmerker og kuttskader. Huden er også rød og kjennes varm.
f) Forklar KORT hva som har skjedd i huden.
Vevsdestruksjon gir en akutt inflammasjon:
Utvidelse av arterioler, økt blodgjennomstrømning i kapillærer og små
vener (ved betennelsesmediatorer). Gir rødme og varme.
Økt permeabilitet i kapillærene, blodplasma og celler fra blodbanen ut i
vevet. Gir hevelse.
Smerten skyldes lokal vevsdestruksjon.
Blåmerker (hematomer) skyldes overrivning av kar, blødning i vevet
(huden).
For at sårene i Annes ansikt skal heles, må huden hennes gjennomgå aktiv celle-deling, hvilket krever energi og aktiv syntese av makromolekyler som DNA, RNA og proteiner.
g) I hvilke organeller foregår syntesen av disse 3 typene makromolekyler?
Syntese av DNA foregår i cellekjernen (replikasjon), RNA-syntese i cellekjernen (transkripsjon), proteinsyntese i cytoplasma, på ribosomene (translasjon), enten frie ribosomer eller på ribosomer festet til Endoplasmatisk Reticulum (proteiner som senere skal modifiseres i ER/Golgi, evt. for frakt til spesifikke organeller eller ut av cellen).
h) Gi en KORTFATTET oversikt over elektrontransportkjeden og beskriv hvordan ATP dannes i denne prosessen.
Elektroner doneres fra NADH til kompleks I, via ulike elektronbærere som er kofaktorer til proteinene som bygger komplekset; elektronbærerne er FMN, Fe-S proteinsenter, og ubiquinone (Coenzym Q) som dissosierer fra kompleks I, ”vandrer” fritt i indre mitokondriemembran, og leverer elektronene videre til kompleks III, deretter til cytokrom C (med hemegruppe som kofaktor) og kompleks IV, som reduserer oksygen til vann. Under denne prosessen vandrer elektronene til gradvis lavere energitilstand, og energien benyttes til å pumpe H+ over indre mitokondriemembran, fra matrix til intermembran-rommet. Denne protongradienten benyttes av enzymet ATP syntase til å danne ATP fra ADP + Pi. Lignende mekanisme forekommer for elektronene fra FADH2, men disse leveres direkte fra FADH2, som er en kofaktor i kompleks II (=succinate dehydrogenase, et enzym i TCA-syklus som også er en direkte del av elektrontransportkjeden) til ubiquinone (Coenzym Q), og det pumpes noe færre protoner over membranen (og dannes en mindre ATP enn for elektronene fra NADH). Ca. 2.5 ATP per NADH, 1.5 ATP per FADH2 (noen tidligere lærebøker som noen studenter har brukt, benytter 3 ATP per NADH og 2 per FADH2, så jeg har godkjent det også).
|
