33
xosligi, iii) fermentning barqarorligi va iv) triptik pe ptidlarning mass-
spektrometriya uchun mosligi kiradi.
4. Peptidlar ionlashtiriladigan ifloslantiruvchi moddalarni yo'q qilish uchun
tuzsizlantirilishi va ta'sir qilishi mumkin MALDI-TOF mass-spektrometriya.
Peptidlarning massasini to'g'ridan-to'g'ri o'lchash oqsilni aniqlash uchun etarli
ma'lumotni berishi mumkin (qarang) Peptidning ommaviy barmoq izlari)
ammo peptidlarning ketma-ketligi haqida ma'lumot olish uchun ko'pincha mass
spektrometr ichidagi peptidlarning keyingi parchalanishidan fo ydalaniladi.
Shu
bilan bir qatorda, peptidlarni tuzsizlantirish va ajratish mumkin teskari
faza HPLC va an-orqali mass-spektrometrga kiritilgan ESI manba. LC-ESI-
MS oqsillarni identifikatsiyalash uchun MALDI-MS ga qaraganda ko'proq
ma'lumot berishi mumkin, ammo ko'proq vaqt sarflaydi.
5. Mass spektrometr turiga qarab, peptid ionlarining parchalanishi turli xil
mexanizmlar orqali sodir bo'lishi mumkin. To'qnashuv natijasida kelib chiqqan
dissotsiatsiya (CID) yoki Manbadan keyingi parchalanish (PSD). Har ikkala
holatda ham peptidning bo'lak ionlari naqshlari uning ketma-ketligi to'g'risida
ma'lumot beradi.
6. Bashoratli peptid ionlarining va ularning
parchalanadigan ionlarining
o'lchangan massasini o'z ichiga olgan ma'lumotlar, keyinchalik kontseptual
(silikodagi) proteolizdan olingan oqsillar ketma-ketligi va ma'lumotlar
bazalarining parchalanishidan hisoblangan massa qiymatlariga mos keladi.
Muvaffaqiyatli o'yin, agar uning natijasi tahlil parametrlari asosida chegara
qiymatidan oshsa topiladi. Haqiqiy oqsil ma'lumotlar bazasida namoyish
etilmagan bo'lsa ham, xatolarga chidamli moslik oqsi lni o'xshashligi asosida
taxminiy identifikatsiyalashga imkon beradi. gomologik oqsillar. Ushbu
tahlilni amalga oshirish uchun turli xil dasturiy ta'minot to'plamlari ma vjud.
7. Dasturiy ta'minot to'plamlari odatda har
bir aniqlangan oqsilning
identifikatsiyasini (qo'shilish kodini), uning mos kelishini ko'rsatadigan
hisobotni tuzadi va bir nechta oqsillar aniqlangan joyda mos keladigan
kuchning o'lchovini beradi.
34
8. Belgilangan oqsilning ketma-ketligi bo'yicha mos keladigan peptidlarning
diagrammasi ko'pincha ketma-ketlikni qoplashni ko'rsatish uchun ishlatiladi
(peptid sifatida aniqlangan oqsilning%). POI mos keladigan oqsildan sezilarli
darajada kichikroq deb hisoblangan joyda, POI aniqlangan oqsilning N- yoki
C-terminal bo'lagi ekanligini taklif qilishi mumkin.
Peptidning parchalanish modeli uning ketma-ketligini to'g'ridan-to'g'ri
aniqlashga
imkon beradi de novo ketma-ketlik. Ushbu ketma-ketlik oqsillar
ketma-ketligining ma'lumotlar bazalariga mos kelish yoki tekshirish uchun
ishlatilishi mumkin tarjimadan keyingi yoki kimyoviy modifikatsiyalar.
Yuqorida aytib o'tilganidek, oqsillarni aniqlash uchun qo'shimcha dalillar
keltirishi mumkin.
Proteinni identifikatsiya qilish paytida mos keladigan peptidlar, mos keladigan
oqsil uchun bashorat qilingan N- yoki C-terminini o'z ichiga olmaydi. Buning
sababi, N- yoki C-terminal peptidlarni MS tomonidan aniqlash qiyin (masalan,
juda qisqa yoki juda uzun), translyatsiyadan so'ng o'zgartirilgan (masalan, N-
terminalli asetilatsiya) yoki bashoratdan chinakam farq qiladi. Translatsiyadan
keyingi modifikatsiyalar yoki qisqartirilgan terminlar ma'lumotlarni batafsil
o'rganish orqali aniqlanishi mumkin (ya'ni.)
de novo ketma-ketlik). Har xil
o'ziga xoslikdagi proteaza yordamida takroriy hazm qilish ham foydali bo'lishi
mumkin.
Translatsiyadan
keyingi
modifikatsiyani
aniqlash
uchun
MS
ma'lumotlarini ma'lum oqsillar ketma-ketligiga asoslangan
bashoratlar bilan
batafsil taqqoslashdan foydalanish mumkin, shuningdek ma'lumotlar yig'ish
uchun
maqsadli
yondashuvlardan
foydalanish
mumkin.
Masalan,
fosfopeptidlarning
o'ziga
xos
boyishi
aniqlashda
yordam
berishi
mumkin fosforillanish oqsil tarkibidagi joylar. Mass-spektrometrda peptid
parchalanishining alternativ usullari, masalan ETD yoki ECD, qo'shimcha
ketma-ketlik ma'lumotlarini berishi mumkin.
Proteinning butun massasi uning aminokislota qoldiqlar i massasi va suv
molekulasi massasining yig'indisidir va har qanday translyatsiyadan keyingi
35
modifikatsiyalar uchun sozlangan. Garchi oqsillar ulardan olingan peptidlarga
qaraganda
kamroq yaxshi ionlashtirsa-da, eritmadagi oqsil ESI-MS ta'siriga
tushishi va uning massasi 20000 dan 1 qismgacha aniqlikda o'lchanishi
mumkin. Bu ko'pincha terminini tasdiqlash uchun etarli bo'ladi (shuning uchu n
oqsilning o'lchangan massasi uning ketma-ketligidan bashorat qilinganiga
to'g'ri keladi) va translyatsiyadan keyingi ko'plab modifikatsiyalar mavjudligi
yoki yo'qligi haqida xulosa chiqarish.
Proteoliz har doim ham POI ketma-ketligini qamrab oladigan, osonlikcha
tahlil qilinadigan peptidlar to'plamini beravermaydi. Mass spektrometrdagi
peptidlarning parchalanishi ko'pincha har bir peptid bog'lanishida bo'linishga
mos keladigan ionlarni hosil qilmaydi. Shunday qilib, har bir peptid uchun
chiqarilgan ketma-ketlik to'liq bo'lishi shart emas. Parchalanishning standart
usullari leytsin va izoleysin qoldiqlarini izome rik bo'lgani uchun ajratmaydi.
Edman degradatsiyasi oqsilning N-terminalidan kelib chiqqanligi sababli, agar
N-terminusi kimyoviy o'zgartirilgan bo'lsa (masalan,
atsetilatsiya yoki
Piroglutamik kislota hosil bo'lishi bilan) ishlamaydi. Edman degradatsiyasi
odatda disulfid ko'priklarining holatini aniqlash uchun foydali emas. Bundan
tashqari, sezgir natijalar uchun 1 pikomol yoki undan yuqori peptid miqdori
talab etiladi, bu esa undan kam sezgir bo'ladi mass-spektrometriya.
