29
1.
Peptidni terminal aminokislotani tanlab belgilaydigan reaktiv
bilan reaksiyaga kiriting.
2.
Oqsilni gidroliz qiling.
Aminokislotani xromatografiya va standartlar bilan taqqoslash orqali aniqla ng.
Terminal aminokislotalarni belgilash uchun ishlatilishi mumkin bo'lgan
juda ko'p turli xil reagentlar mavjud. Ularning barchasi omin guruhlari bilan
reaksiyaga kirishadi va shu sababli lizin kabi
aminokislotalarning yon
zanjiridagi amin guruhlari bilan ham bog'lanadi - shu sababli to'g'ri joy
tanlanganligini ta'minlash uchun xromatogrammalarni izohlashda ehtiyot
bo'lish zarur. Eng keng tarqalgan reaktivlardan ikkitasi
Sanger reaktivi (1-
ftor-2,4-dinitrobenzol)
va
kabi
dansil
hosilalari dansil
xlorid. Fenilizotiyosiyanat, Edman degradatsiyasi
uchun reaktivdan ham
foydalanish mumkin. Xuddi shu savollar aminokislota tarkibini aniqlashda
bo'lgani kabi amal qiladi, faqat dog 'kerak emas, chunki reaktivlar rangli
hosilalarni hosil qiladi va faqat sifatli tahlil talab qilinadi.
Shunday qilib,
aminokislota faqat standart bilan taqqoslaganda, xromatografiya kolonkasidan
chiqarilishi shart emas. Shuni ham hisobga olish kerakki, har qanday omin
guruhlari markalash reagenti bilan reaksiyaga kirishganligi sababli, ion
almashinadigan xromatografiyadan foydalanish
mumkin emas va yupqa
qatlamli xromatografiya yoki yuqoribosimli suyuqlik xromatografiyasi o'rniga
ishlatilishi kerak.
Mavjud bo'lgan usullarning soni C-terminali aminokislotalar tahlili
mavjud bo'lgan N-terminalli tahlil usullaridan ancha kichikdir. Eng keng
tarqalgan usul - qo'shish karboksipeptidazalar oqsil eritmasiga, ma'lum vaqt
oralig'ida
namunalar
oling
va
vaqtga
qarab
aminokislotalar
konsentratsiyasining
uchastkasini tahlil qilib, terminal aminokislotani
aniqlang. Ushbu usul polipeptidlar va oqsil bloklangan N termini holatida juda
foydali bo'ladi. C-terminal sekvensiyasi DNK sekanslaridan bashorat qilingan
oqsillarning birlamchi tuzilmalarini tekshirishda va ma'lum bo'lgan kodon
30
sekanslaridan gen mahsulotlarini translyatsiyadan keyingi qayta ishlashini
aniqlashda katta yordam beradi.
Asosiy maqola: Edman degradatsiyasi
The Edman degradatsiyasi oqsillarni ketma-ketligi
uchun juda muhim
reaktsiya, chunki u oqsilning buyurilgan aminokislota tarkibini topishga imkon
beradi.
Avtomatlashtirilgan
Edman
sekvensionlari
hozirda
keng
qo'llanilmoqda va peptidlarni taxminan 50 ta aminokislotalarga qadar ketma -
ketlik qilishga qodir. Edman degradatsiyasi bilan oqsilni ketma -ketligi uchun
reaktsiya sxemasi quyidagicha; keyinchalik ba'zi qadamlar ishlab chiqi lgan.
1. Har qanday sindirish disulfidli ko'priklar a bilan oqsilda kamaytiruvchi
vosita kabi 2-merkaptoetanol.
A himoya
guruhi kabi yod
sirka
kislotasi aloqalarning qayta shakllanishiga yo'l qo'ymaslik uchun kerak bo'lishi
mumkin.
2. Agar bir nechta bo'lsa, oqsil kompleksining alohida zanjirlarini ajratib oling va
tozalang.
3. Har bir zanjirning aminokislota tarkibini aniqlang.
4. Har bir zanjirning terminal aminokislotalarini aniqlang.
5. Har bir zanjirni 50 ta aminokislota ostida bo'laklarga bo'ling.
6. Parchalarni ajratib oling va tozalang.
7. Har bir fragmentning ketma-ketligini aniqlang.
8. Boshqa dekolte naqshini takrorlang.
9. Umumiy oqsilning ketma-ketligini tuzing.
Taxminan 50-70 aminokislotadan uzunroq bo'lgan peptidlarni Edman
degradatsiyasi bilan ishonchli ravishda ketma-ket qilib bo'lmaydi. Shu sababli,
uzun protein zanjirlarini kichik bo'laklarga
ajratish ke rak, keyinchalik ularni
alohida-alohida tartiblash mumkin. Ovqat hazm qilish ham tomonidan amalga
oshiriladi endopeptidazlar kabi tripsin yoki pepsin yoki
kabi
kimyoviy
reagentlar tomonidan amalga oshiriladi siyanogen bromid. Turli xil fermentlar
turli xil dekolte naqshlarini beradi va parchalar orasidagi ustma-ust umumiy
ketma-ketlikni yaratish uchun foydalanish mumkin.
31
Tartibga
solinadigan
peptid
bu adsorbsiyalangan qattiq
yuzaga
Umumiy substrat bilan
qoplangan shisha tola polibren, a katyonik polimer.
Edman
reaktivi, fenilizotiyosiyanat (PITC),
adsorbsiyalangan
peptidga
yumshoq asos bilan qo'shiladi buferli eritma 12% dan trimetilamin. Bu N-
terminal aminokislotaning amin guruhi bilan reaksiyaga kirishadi.
Keyin
terminal
aminokislota
qo'shilishi
bilan
tanlab
ajratilishi
mumkin suvsiz kislota.
Keyin
lotin izomeriyalar almashtirishni
berish feniltiyohidantoin, uni yuvish va xromatografiya yordamida aniqlash va
tsiklni takrorlash mumkin. Har bir qadamning samaradorligi taxminan 98% ni
tashkil etadi, bu taxminan 50 ta aminokislotani ishonchli aniqlashga imkon
beradi.
