Mavzuning dolzarbligi. Tibbiy genomika biologiya fanining eng tez
rivojlanayotgan yo'nalishlaridan biridir. So'nggi 25 yil ichida kuzatilgan
tibbiyotning ushbu yo'nalishi "Inson genomi" xalqaro loyihasining boshlanishi bilan
bog'liq. Ushbu mavzuni chuqur o’rganish,ushbu mavzu haqidagi bilimlarni
rivojlantirish bugungi kunda asosiy masalalardan biridir.
Kurs ishining maqsad va vazifalari. Oqsillardagi barqarorlik va aylanish
(Folding) mavzusini o’rganish hama mutatsion kasalliklarning oldini olish chora
tadbirlarini rivojlantirishdan iborat.
Kurs ishining tuzilishi: Kurs ishi kirish ,asosiy qism, xulosa 3 ta rasm,
foydalanilgan adabiyotlar ro’yxati, Jami 26 betdan iborat
7
I BOB Oqsillardagi barqarorlik va aylanish (Folding)
1.1. Oqsillardagi barqarorlik va aylanish
Oqsillarni ketma-ketligi ni aniqlashning amaliy jarayoni aminokislotalar
ketma-ketligi a yoki qisman oqsil yoki peptid. Bu oqsilni aniqlashga yoki
uning
xarakteristikasiga
xizmat
qilishi
mumkin tarjimadan
keyingi
modifikatsiyalar. Odatda, oqsilning qisman ketma-ketligi, uni kontseptual
asoslardan kelib chiqqan oqsillar ketma-ketligining ma'lumotlar bazalariga
asoslanib aniqlash uchun etarli ma'lumot (bir yoki bir nechta ketma-ketlik
yorliqlari) beradi. tarjima ning genlar.
Proteinlarni ketma-ketlikning ikkita asosiy to'g'ridan-to'g'ri usullari mass-
spektrometriya va Edman
degradatsiyasi yordamida oqsil
sekvenatori (sekvensiya). Ommaviy spektrometriya usullari hozirgi kunda
oqsillarni ketma-ketligi va identifikatsiyasi uchun eng keng qo'llaniladi, ammo
Oqsillardagibarqarorlik va aylanish
Ushbu hujjatda men protein barqarorligi haqida umumiy ma'lumot beraman.
Har bir qoldiqning oqsil barqarorligiga qo'shadigan yoki olib tashlaydigan hissasi
kichikdir. Shunday qilib, oqsilning barqarorligi ko'p miqdordagi kichik ijobiy va
salbiy o'zaro ta'sir energiyalari bilan belgilanadi. Keyingi bo'limlarda men ushbu
ijobiy va salbiy o'zaro ta'sir energiyalarini keltirib chiqaradigan ba'zi omillarni
muhokama qilaman. Men shuningdek, idrok etilgan barqarorlik ( kinetik
barqarorlik) , oqsillarning kimyoviy degradatsiyasi va barqarorlik evolyutsiyasi
bilan bog'liq bo'lgan rivojlanish tezligini qisqacha muhokama qilaman
.Proteinlardagi barqarorlik haqida bahslashishdan oldin, biz barqarorlik deganda
nimani nazarda tutayotganimizni aniq belgilashimiz kerak. Bu so'z turli odamlar
tomonidan turlicha qo'llaniladi. Masalan, fizik biokimyogar va biotexnolog
barqarorlik haqida gapirganda har xil narsani anglatishi mumkin.
Jismoniy biokimyogar, bir tomondan, oqsil barqarorligini birinchi navbatda
tez, teskari, hamkorlikda va oddiy, ikki holatli mexanizm bilan ochiladigan va qayta
katlanadigan oqsilning termodinamik barqarorligi nuqtai nazaridan muhokama
qiladi:
8
Buklanish va barqarorlikni o'rganish uchun eng oson oqsillar bu tez qaytarilish
xususiyatini ko'rsatadigan oqsillardir. Eksperimental dizayn ham, ma'lumotlarning
nazariy ishlovi ham qaytariladigan tizimlar tomonidan soddalashtirilgan. Shunday
qilib, barqarorlik to'g'risidagi ko'pgina adabiyotlarda bu turdagi teskari tizimni
muhokama qilish ajablanarli emas. Ushbu dissertatsiyaning asosiy qismi
termodinamik barqarorlikka ham qaratiladi.
Bunday hollarda oqsilning barqarorligi oddiygina Gibbs erkin energiyasidagi
farq, G, buklangan va ochilgan holatlar o'rtasidagi farqdir. Barqarorlikka ta'sir
etuvchi omillar buklangan (G f ) va ochilgan (G u ) holatlarning nisbiy erkin
energiyalaridir. G u qanchalik katta va ijobiy bo'lsa, oqsil denaturatsiyaga
shunchalik barqaror bo'ladi.
Gibbsning erkin energiyasi, G, tenglama bilan bog'liq bo'lgan ikkita entalpiya
(H) va entropiya (S) atamalaridan iborat:
Katlanuvchi erkin energiya farqi, G u , odatda kichik bo'lib, globulyar oqsil
uchun 5-15 kkal/mol (masalan, kovalent bog'lanish uchun ~30-100 kkal/mol bilan
solishtirganda).
Boshqa tomondan, biotexnolog ta'rifning amaliy foydasi bilan ko'proq
shug'ullanadi: oqsil qattiq harorat yoki erituvchi sharoitida ishlash uchun etarlicha
barqarormi? Bu savolga javob termodinamik barqarorlikda bo'lishi mumkin bo'lsa-
da (yuqorida muhokama qilingan); u oddiygina qaytaruvchanlikda yoki qaytarilmas
yoki asta-sekin ochiladigan oqsillar uchun kinetik barqarorlikda yotishi mumkin.
Agar oqsil teskari yo'l bilan ochilgan bo'lsa, u yuqori haroratlarda to'liq
ochilishi va faol bo'lmasligi mumkin, lekin u xona haroratiga soviganidan so'ng, u
qayta tiklanadi va faollikni to'liq tiklaydi. Funktsional nuqtai nazardan, bu uning
termostabil deb tasniflanishi uchun zarur bo'lgan barcha narsa bo'lishi mumkin.
Biroq, termodinamik nuqtai nazardan (va ushbu dissertatsiya nuqtai nazaridan) u
termostabil bo'lmagan deb tasniflanadi.
Qaytarib bo'lmaydigan yoki asta-sekin ochiladigan oqsillar bo'lsa, kinetik
barqarorlik yoki ochilish tezligi muhim ahamiyatga ega. Kinetik jihatdan barqaror
bo'lgan oqsil kinetik jihatdan beqaror proteinga qaraganda sekinroq ochiladi. Kinetik
9
barqaror oqsilda ochilish uchun katta erkin energiya to'sig'i talab qilinadi va
barqarorlikka ta'sir etuvchi omillar ochilish yo'lidagi birinchi qat'iy qadam uchun
buklanganlarning nisbiy erkin energiyalari (G f ) va o'tish holati (G ts ) hisoblanadi.
Kinetik barqarorlik o'z bo'limida batafsilroq muhokama qilinadi; qarang Kinetik
barqarorlik . Protein qatlamli tuzilishining qaytarilmas yo'qolishi quyidagilar bilan
ifodalanadi:
Bu yerda k i - qaytarilmas inaktivatsiya jarayoni uchun tezlik konstantasi.
Tez faolsizlanayotgan oqsil uchun erkin energiya profili quyida ko'rsatilgan.
E'tibor bering, katlanmış shaklga erishilgandan so'ng, inaktivatsiya uchun energiya
to'sig'i qayta katlamaga qaraganda pastroq bo'ladi.Protein barqarorligiga ta'sir
qiluvchi asosiy omillar
hidrofobik o'zaro ta'sirlar
vodorod aloqalari
konformatsion entropiya
Adabiyotlar oqsillarda eng ko'p tarqalgan ikki turdagi o'zaro ta'sirlar (i) hidrofobik
o'zaro ta'sirlar va (ii) vodorod aloqalari ekanligi haqida umumiy kelishuv mavjud .
Ushbu bog'lanishlarning ochilgan holatdan buklangan holatga o'tishdagi reaktsiyasi
quyidagi multfilmda jamlangan.
Hidrofobik qismlarning ko'milishi va oqsil katlamalarida molekula ichidagi
H-bog'larning shakllanishi ko'rsatilgan diagramma. Buklanish paytida suv
molekulalarining ajralib chiqishiga e'tibor bering. ( Pace va boshq. , 1996 dan
olingan .)
Garchi bu ikkala o'zaro ta'sir bir qoldiq uchun kichik bo'sh energiyaga ega
bo'lsa-da, ular juda muhim, chunki ular juda ko'p. Xuddi shu narsa ochilgan holatni
barqarorlashtiradigan o'zaro ta'sirlar uchun ham amal qiladi. Ulardan eng muhimi
konformatsion entropiyadir . Shunday qilib, katlanmış oqsilning umumiy erkin
energiyasi ikkita katta son orasidagi kichik farq bilan beriladi. Bu protein
barqarorligini miqdoriy hisoblashning qiyinligining asosiy sababidir. RNase T1
barqarorligiga hissa qo'shadigan omillarning yaqinda o'tkazilgan tahlilida
barqarorlashtiruvchi va beqarorlashtiruvchi o'zaro ta'sirlar mos ravishda 271 va 286
10
kkal / mol deb baholandi ( Peys va boshq. , 1996) .). Vodorod bilan bog'lanish va
gidrofobik o'zaro ta'sirlar barqarorlashtiruvchi o'zaro ta'sirlarga 260 kkal / mol hissa
qo'shishi taxmin qilingan, beqarorlashtiruvchi omillarning asosiy qismi
katlamalarda konformatsion entropiyaning yo'qolishi va peptid va qutbli
guruhlarning noqulay ko'milishiga bog'liq. Jadvalga qarang.
Beqarorlashtiruvchi
Erkin energiya (kkal/mol)
Konformatsion entropiya
-177
Ko'milgan peptid guruhlari
-81
Dafn etilgan qutbli guruhlar
-28
Umumiy beqarorlik
-286
Stabillashtirish
Histidinning ionlanishi +4
Disulfid aloqalari +7
Ko'milgan gidrofobik guruhlar +94
Vodorod aloqasi +166
Umumiy barqarorlashtirish
+271
------------------------------------------------- ---------
G (taxminan)
-15
G (o'lchangan)
+9Protein barqarorligiga ta'sir qiluvchi boshqa omillar
Yuqorida muhokama qilinganlarga qo'shimcha ravishda bir qator boshqa o'zaro
ta'sirlar mavjud ( Gidrofobik ta'sir , Vodorod aloqalari , Ochilishning konformatsion
entropiyasi ), ular oqsillarning barqarorligiga hissa qo'shadi. Ushbu o'zaro ta'sirlar
asosiy omillarga nisbatan kam , ammo protein barqarorligi uchun hali ham muhim
ahamiyatga ega. Ularga quyidagilar kiradi:
Tuzli ko'priklar
Aromatik-aromatik o'zaro ta'sirlar
Metall bog'lash va
Disulfid aloqalariTuzli ko'priklar
11
Tuz ko'prigi yoki ion juftlari ikkita zaryadlangan qoldiq o'rtasidagi o'zaro
ta'sirdan tashkil topgan kuchli vodorod aloqalarining maxsus shaklidir.
Tuz ko'prigining namunasi ushbu PPS havolasida topilgan.
Tuz ko'priklarining oqsil barqarorligiga qo'shgan hissasi adabiyotda biroz
bahsli masaladir. Bir tomondan, mezofil oqsillarning termofil va giper-termofil
analoglari tuz ko'prigi sonining ko'payishini kuzatishdir ( Tanner va boshq. , 1996 ;
Perutz & Raidt, 1975 ; Perutz, 1978; Dekker va boshq., 1991). ). Boshqa tomondan,
mutatsion tadqiqotlar tuz ko'priklarining barqarorlikka qo'shgan hissasi kichik
ekanligini ko'rsatadi. Ehtimol, yuqori haroratlarda tuz ko'prigi barqarorlikka ko'proq
hissa qo'shadi.
Horovitz va boshqalar . (1990) 1, 2 yoki 3 alanin mutantlarining barcha
mumkin bo'lgan kombinatsiyalarining termodinamik siklini qurish orqali barnaza
yuzasida Asp8, Asp12 va Arg110 o'rtasidagi sirt tuzli ko'prigi triadasining
barqarorligini o'lchadi. Proteinning barqarorligiga erkin energiya hissasi
Asp12/Arg110 juftligi uchun atigi 1,25 kkal/mol va Asp8/Arg110 juftligi uchun 0,98
kkal/mol ni tashkil qiladi. Arg 110 ni olib tashlash barqarorlikka ta'sir qilmaydi!
Barnase tuz ko'prigi gif uchun bu yerni bosing va pdb ga havola.
Boshqa tadqiqotlar ham xuddi shunday natijalarga ega ( Akke & Forsen, 1990
). Ushbu hissalarning bunday ion juftligining kuchidan kutilgan darajada katta
emasligining sabablaridan biri shundaki, tuz ko'prigi hosil qilish uchun suv bilan
kuchli vodorod aloqalari uzilishi kerak. Aslida, stabilizatsiya energiyasining katta
qismi ion jufti hosil bo'lganda erituvchi entropiyasining ortishidan kelib chiqishi
mumkin.
Yuzaki tuz ko'priklaridan farqli o'laroq, ko'milgan tuz ko'prigidan bir sherikni
olib tashlash 3-4 kkal / mol ning beqarorligiga olib keladi. Shu bilan birga, ko'milgan
tuz-ko'prik triadasini yaxshi o'ralgan hidrofobik qoldiqlar bilan almashtirish (uchta
zaryadlangan qoldiq holatida tasodifiy mutagenez natijasida topilgan) yoy
repressorida 4,5 kkal / mol barqarorligini oshirishga olib kelishi aniqlandi (
Waldburger va boshqalar . ., 1995 ). Shunday qilib, hidrofobik shovqinlar tuz
ko'prigi triadasidan ko'ra barqarorlikka ko'proq hissa qo'shadi. Bu quyida
12
tasvirlangan va, ehtimol, ochilgan holatdan buklangan holatga o'tishda zaryadlangan
guruhlarni yechish xarajatlari bilan bog'liq. Mutant R31M, E36Y, R40L.
Yovvoyi turdagi yoy repressorining giflari va mutant va pdb havolalari uchun bu
yerni bosing.
Qizig'i shundaki, yovvoyi turdagi yoy repressorining mutantga qaraganda
sekinroq 10 dan 1250 gacha katlanishi ham ko'rsatildi ( Waldburger va boshq. , 1996
). Bu zaryadlangan qoldiqlarni ko'mish uchun yuqori energiya to'sig'i bilan bog'liq
bo'lishi taklif etiladi. Agar bir zaryadlangan qoldiq boshqasidan oldin ko'milishi
kerak bo'lsa, o'tish holati ayniqsa yuqori energiyaga ega bo'ladi. Tuz ko'prigi o'tish
holatidan oldin shakllangan bo'lsa ham, tuz ko'prigining geometriyasi oqsilning bu
qismi o'zining tabiiy konformatsiyasiga erishmaguncha optimal darajada bo'lmasligi
mumkin. Hidrofobik o'zaro ta'sirlar kamroq sterik talabga egaAromatik-aromatik
o'zaro ta'sirlar
Proteinlarda joylashgan aromatik yon zanjirlarning (Phe, Tyr va Trp)
taxminan 60% aromatik juftliklarda ishtirok etadi. Model birikmalari bilan olib
borilgan tadqiqotlar shuni ko'rsatadiki, optimal geometriya perpendikulyar bo'lib,
bir halqaning chetidagi qisman musbat zaryadlangan vodorodlar ikkinchisining pi
elektronlari va qisman manfiy zaryadlangan uglerodlari bilan ijobiy ta'sir o'tkazishi
mumkin. Ushbu kuzatishlar natijasida bunday o'zaro ta'sirlar oqsil barqarorligiga
hissa qo'shishini kutish mumkin. Bu barnaza yuzasida Tyr13 / Tyr17 juftligi
ta'sirlangan hal qiluvchi ustida sinovdan o'tkazildi ( Serrano va boshq., 1991 ). Tyr13
va Tyr17 ham Ala, ham Phe ga mutatsiyaga uchragan.
Barnazadagi Tyr13/Tyr17 aromatik o'zaro ta'sirini ko'rsatadigan gif uchun bu
yerni bosing va pdb ga havola qiling.
Tyr13 yoki Tyr17 ning Phega mutatsiyasi barqarorlikning 0,30 yoki 0,41
kkal/mol, qo'sh mutantda esa 0,61 kkal/mol pasayishiga olib keladi. Ikkala gidroksil
guruhi hal qiluvchi ta'siriga duchor bo'lganligi sababli (ular ochilgan holatda bo'lishi
mumkin), bu kichik beqarorlikning manbai aniq emas. Shu bilan birga, er-xotin
alanin mutantiga mutatsiya barqarorlikning 4,6 kkal/mol ga pasayishiga olib keladi.
Ushbu beqarorlikning aksariyati tirozin qoldiqlari va oqsilning qolgan qismi
13
o'rtasidagi o'zaro ta'sirlarning yo'qolishi bilan izohlanishi mumkin; ammo,
termodinamik davrlar yordamida ma'lumotlarni tahlil qilish ( Carter, 1984 ; Horovitz
& Fersht, 1990) .) ikkita aromatik guruh o'rtasidagi o'zaro ta'sir energiyasi oqsil
barqarorligiga atigi 1,3 kkal/mol hissa qo'shishini ko'rsatadi. Bu ular orasidagi
ko'milgan sirt maydonidan hidrofobik hissadan kutilgan barqarorlashuvdan biroz
yuqoriroqdir. Bu holda, shuning uchun aromatik juftlik tufayli juda oz ko'rinadigan
qo'shimcha barqarorlik mavjud.Metall bog'lash
Proteinlarning buklangan holatini barqarorlashtirishning yana bir usuli - bu
metall bilan bog'lanishdir, bunda metall ionlari muvofiqlashtiriladi, odatda kislorod
yoki azot atomlaridan bir juft donorlik.
Mana, PDB ning GIF rasmlari to'plamidan sinkni bog'laydigan oqsil,
karboksipeptidaza A ning rasmi.
Shuningdek, Jeyn Richardsonning "Protein turisti" filmidagi misollarni
ko'ring.
Tajribalar shuni ko'rsatdiki, metall bilan bog'lanish barqarorlikka 6 - 9 kkal /
mol ( Braxton, 1996 va undagi havolalar) hissa qo'shishi mumkin. Biroq, bu biroz
noto'g'ri, chunki taqqoslashlar apo- va holo-ferment o'rtasida; apo-fermentda
ko'pincha kislotali yon zanjirlarni muvofiqlashtirishdan salbiy zaryadning
beqarorlashtiruvchi klasteri mavjud. Metall bilan bog‘lanishining oqsil
barqarorligiga qo‘shgan hissasini yanada adolatli baholash izo-sitoxrom c ning alfa
spiraliga metall xelatlash joyi kiritilgan va u mavjud bo‘lganda barqarorlikning 1
kkal/mol ga oshishiga olib kelgan tajribadan olingan bo‘lishi mumkin. to'yingan Cu
(II) ( Kellis va boshqalar , 1991 ). Yana bir qiziqarli tadqiqot Kuroki va
boshqalar.(1989). Ular alfa-laktalbumin (Ca 2+ bilan bog'lanishi) va c tipidagi
lizozimlarning (Ca 2+ bog'lanmagan) ketma-ketligi va uchinchi tuzilishi homolog
ekanligini kuzatdilar.
Ular alfa-laktalbumindan inson C tipidagi lizozimga (Q86D/A92D) bog'lanish
joyini jalb qilishdi. Mutant oqsil bir mol kaltsiy ionlarini bog'laydi va yovvoyi turga
qaraganda taxminan 10 ° C yuqori optimal faollikka ega. Qizig'i shundaki, apo-
ferment yovvoyi turga qaraganda taxminan 5 °C kamroq barqaror.Disulfid aloqalari
14
Disulfid aloqalari ikkita sistein qoldig'ining oksidlanishi natijasida hosil
bo'lgan kovalent oltingugurt-oltingugurt bog'lanishini hosil qiladi, ular intra- (
misollar Jeyn Richardsonning Protein turistik kinamajida ko'rsatilgan ) yoki inter- (
ushbu PPS havolasida insulin misolida keltirilgan ) molekulyar ko'priklar bo'lishi
mumkin.
Kovalent disulfid bog'lanishning entalpiyasi juda yuqori bo'lgani uchun u
barqarorlikka katta hissa qo'shadi, deb tasavvur qilish mumkin . Biroq, bu bog'lanish
ham buklangan , ham ochilgan holatda mavjud, shuning uchun uning erkin energiya
farqiga
entalpik
hissasi
ahamiyatsiz.
Disulfid
bog'lanishning
barcha
barqarorlashtiruvchi ta'siri yuqoridagi "Ochilishning konformatsion entropiyasi" da
tavsiflanganidek, ochilgan holatning konformatsion entropiyasining pasayishidan
kelib chiqadi .
Hisob-kitoblar shuni ko'rsatadiki, disulfid aloqasi o'zaro bog'lanishlar
orasidagi asosiy ketma-ketlikni ajratishga qarab 2,5 - 3,5 kkal / mol stabilizatsiyaga
olib kelishi kerak ( Braxton, 1996 ). Tabiiy disulfidlar alaninga mutatsiyaga
uchragan yoki kimyoviy jihatdan kamaygan va bloklangan tajribalar barqarorlikni
2-8 kkal/mol gacha pasayishiga olib keladi ( Betz, 1993 va undagi havolalar).
Afsuski, bu tajribalar bo'shliqlarni yoki ko'milgan qutbli guruhlarni qoldirishi yoki
disulfid ko'prigini olib tashlashdan ko'ra ko'proq oqibatlarga olib kelishi sababli,
faqat o'zaro bog'lanishlar tufayli barqarorlikni baholash qiyin.
Oqsillarga yangi disulfidlarning kiritilishi ham aralash natijalar berdi. T4
lizozimiga beshta disulfid kiritilgan (uning yovvoyi turida disulfidlari yo'q). Ikkisi
beqarorlashmoqda va uchtasi qisqartirilgan shaklga nisbatan barqarorlashmoqda,
ammo beshtasi ham yovvoyi turga nisbatan beqarorlashgan ( Betz, 1993 )! Biroq,
disulfidlarni kiritish orqali muvaffaqiyatli stabilizatsiyalar mavjud: RNase Hn ning
barqarorligi disulfid kiritilganda 2,8 kkal / mol ga oshadi. Ribonukleaz barnaza
ichiga muhandislik disulfidlari 1,2 va 4,1 kkal / mol ( Clarke va boshq., 1995 )
barqarorligini oshirdi. Qizig'i shundaki, birinchi disulfid 34 ta qoldiqdan iborat
bo'lakni o'z ichiga oladi, ikkinchisi esa 17 tani o'z ichiga oladi.
15
Bu barnase tuzilmalari va ularning pdb havolalari bu erda ko'rsatilgan.
Agar barqarorlashuv faqat konformatsion entropiya tufayli bo'lsa,
stabilizatsiya kattaligi teskari bo'ladi; bundan tashqari, 17 qoldiq pastadir (4,1 kkal /
mol) uchun kuzatilgan stabilizatsiya darajasi nazariya ( Betz, 1993 ) tomonidan
bashorat qilinganidan yuqori . Shunday qilib, biz disulfidlarning oqsil tarkibidagi
rolini tushunishdan hali ham uzoq ekanligimiz aniq.
Shunisi e'tiborga loyiqki, kichik oqsillar ko'pincha tabiiy ravishda disulfid
aloqalariga boy ( misollar Jeyn Richardsonning Protein turistik kinamajida
ko'rsatilgan ); ehtimol, geometriya optimal bo'lganda, ular kovalent bo'lmagan o'zaro
ta'sirlarning kam sonini qoplaydi.
Giper termostabil oqsillarda disulfid birikmalari kamdan-kam uchraydi,
chunki ular yuqori haroratlarda kimyoviy jihatdan labildir.Kinetik barqarorlik
Kinetik barqarorlik, bu erda muhokama qilingan kontekstda, oqsilning qanchalik tez
tarqalishining o'lchovidir. Bu juda sekin ochiladigan yoki qaytarib bo'lmaydigan
tarzda denatüratsiyalanadigan oqsillar uchun ayniqsa muhim ahamiyatga ega. Agar
ochilmagan oqsil tezda agregatsiya (tuxum oqi) yoki proteolitik degradatsiya
(subtilisin) kabi doimiy o'zgarishlarga duchor bo'lsa, oqsil qaytarib bo'lmaydigan
tarzda denatüratsiyasi mumkin.
Bu kabi holatlarda buklangan va ochilgan holat o'rtasidagi erkin energiya farqi
muhim emas. Bu faqat muvozanatga ta'sir qiladi va bu muvozanat jarayoni emas.
Muhimi, buklangan va o'tish holatlari o'rtasidagi erkin energiya farqi (faollashuv
energiyasi), chunki bu farqning kattaligi ochilish tezligini (va shuning uchun
inaktivatsiyani) belgilaydi.
Boshqa tomondan, bu kuzatuv (teskari: ochilgandan buklangan) katlanmış
oqsil struktura uchun global energiya minimalini aks ettiradi degan nazariya uchun
ba'zi oqibatlarga olib keladi. Agar global minimal darajaga erishish uchun zarur
bo'lgan faollashtirish energiyasi shunchalik yuqori bo'lsa, bu to'g'ri emas. Bunday
holda, struktura barcha maqsad va maqsadlarga ko'ra, mahalliy minimal darajada
tuzoqqa tushadi va mahalliy minimallashtirilgan struktura ushbu protein uchun
buklangan holat bo'ladi.
16
Bu holat subtilisin tomonidan tasvirlangan, bu katlama uchun katalizator
sifatida pro-ketlikni talab qiladi; yakuniy tuzilishda pro-ketlik talab qilinmaydi,
lekin katlamaning faollashuv energiyasini 27 kkal/mol dan ortiq pasaytiradi. Agar
bu ketma-ketlik bo'lmasa, past energiyali yakuniy katlama tuzilishiga erishib
bo'lmaydi. Ushbu kontseptsiya Beyker va Agard (1994) tomonidan batafsilroq
muhokama qilingan .
Qaytarib bo'lmaydigan darajada ochiladigan bir nechta oqsillarning
katlanmasi / barqarorligi batafsil o'rganilganligi sababli, men barnaza disulfid
mutantlarining ochilish kinetikasi bo'yicha mutatsiyali tadqiqotni muhokama
qilaman ( Clarke and Fersht, 1993 ). SDM yordamida muvozanat va kinetik katlama
va ochish tadqiqotlari bilan birgalikda ushbu oqsilning katlama yo'li va o'tish holati
xaritaga tushirildiDisulfid aloqalari ochilish yo'lida erta buziladigan pozitsiyalarda
(43/80) va ochilish yo'lida kech buziladigan pozitsiyalarda (85/102) kiritilgan.
Muvozanat barqarorligi va ochiladigan kinetika o'lchandi ( Clarke and Fersht, 1993
). (Barqarorlik avvalgi bo'limda muhokama qilingan disulfid bog'lari .) Kamroq
barqaror 43/80 mutant 170 marta sekinroq va barqarorroq bo'ladi.85/102 mutant
disulfid aloqasi kamaytirilgandan ko'ra 17 marta sekinroq. Shunday qilib, ochilish
yo'lida erta buziladigan muhandislik disulfid bog'lovchi hududlarning mavjudligi
ochilish tezligining ochilish yo'lida kech bo'lgan disulfid bog'lovchi mintaqalari
mavjudligiga qaraganda 10 marta ko'proq pasayishiga olib keladi; Garchi tezroq
ochiladigan mutant termodinamik jihatdan barqarorroq bo'lsa ham. Buning
qaytarilmas tizimlarda kinetik barqarorlikni muhandislik yoki tekshirish uchun
oqibatlari shundan iboratki, oqsilning o'tish holatida hali to'liq shakllangan
qismlarida qilingan o'zgarishlar kuzatilgan inaktivatsiya tezligiga kam ta'sir
qiladi.Faqat buklangan va o'tish holatida turli tuzilmalarga ega bo'lgan hududlardagi
o'zgarishlar kuzatilgan inaktivatsiya tezligiga ta'sir qiladi. Afsuski, barnase uchun
mavjud bo'lgan katta ma'lumotlar to'plami yo'qligi sababli, qaysi mintaqalar ochilish
yo'lida erta yoki kech bo'lishini oldindan aytish mumkin emas va sinov va xatolik,
ehtimol, mavjud bo'lgan eng yaxshi yondashuvdir.
17
Barnaza kabi oqsillar uchun, hatto eng sekin ochiladigan disulfid mutantining
ochilish tezligi konstantasi taxminan 1 mS bo'lsa, bu tahlil foydali funktsiya uchun
muhim emas. Biroq, sekin va qaytarib bo'lmaydigan tarzda ochiladigan oqsillar
uchun bu printsipni qo'llash muhim ahamiyatga ega. Bacillus lichiniformis dan
yuqori termostabil alfa amilaza sekin va qaytmas tarzda ochiladi; karbamid
denaturatsiyasi bilan ochilishi yarim soatlik vaqtga ega (S.Miraglia, nashr
etilmagan). Mutantlar strukturaning turli qismlarida qurilgan va hatto bir mintaqa
atrofida to'plangan keskin mutatsiyalar barqarorlikka juda kam ta'sir qiladi yoki
umuman ta'sir qilmaydi (nashr etilmagan A. Day), bu hududlar hali ham ochilish
uchun o'tish holatida to'liq shakllanganligini ko'rsatadi.Kimyoviy degradatsiya
Shuni ta'kidlash kerakki, oqsil qat'iylikni barqarorlashtirish orqali qanchalik
barqaror bo'lishi mumkin bo'lsa, oqsil barqarorligining yakuniy chegarasi kovalent
degradatsiyadan kelib chiqishi kerak. Yuqori haroratlarda (80 - 120 ° C) Asn va Gln
deamidlanishga moyil, Asp-Xaa peptid bog'lari gidrolizga moyil, disulfid bog'lari
yorilib, Xaa-Pro peptid bog'lari cis-trans izomerizatsiyasiga uchraydi (bu erda Xaa
har qanday aminokislotadir. ).
Qizig'i shundaki, protein kimyoviy termostabilligining yuqori chegarasi
model mezofil fermentlarni o'z ichiga olgan tadqiqotlarda hisoblanganidan yuqori
bo'lishi mumkin. Faqatgina bu qoldiqlardan qochishning ahamiyatsiz javobidan
tashqari (giper-termofillarda disulfidlar yo'q va Asn/Gln miqdori kamayadi), Gln va
Asn qoldiqlarining deamidlanish tezligi, ehtimol, sterik cheklash tufayli, to'liq
buklangan holda kamayishi kuzatiladi. gipertermofil tuzilmalar ( Vielle va Zeikus,
1996 va undagi havolalar).Evolyutsiya va oqsil barqarorligi
Nima uchun oqsillarning ko'pchiligi faqat 5-15 kkal/mol darajasida barqaror?
Ehtimol, xuddi shu sababdan, biz tanklarda yurmaymiz. Evolyutsion bosim
oqsilning (yoki avtomobilning) o'z vazifasini bajarishi uchun etarlicha kuchli
bo'lishidir, lekin kuchliroq emas. Agar oqsil barqarorlashtiruvchi mutatsiyani
(boshqa hech qanday ta'siri yo'q) to'plasa, uni barqaror ushlab turish uchun
evolyutsion bosimsiz, u tez orada boshqa beqarorlashtiruvchi mutatsiyani to'plashi
mumkin. Biroq, agar bu oqsil uning ishlash qobiliyatini buzadigan
18
beqarorlashtiruvchi mutatsiyani to'plasa, tabiiy tanlanish uni tezda yo'q qiladi. Buni
ko'rsatadigan misollardan biri, barnazaning binase deb ataladigan yaqin homologga
mutatsiyasidir ( Serrano va boshqalar, 1993 ). Ushbu oqsillar 110 ta aminokislotadan
17 ta farqga ega va yuqori darajada supero'tkazuvchi tuzilmalarga ega.Har bir
individual mutatsiya barnazadan binazagacha qilingan va bu nuqta mutatsiyalarining
har biri faqat +1,1 va -1,1 kkal/mol orasida barqarorlikka ta'sir qilgan. Bu shuni
ko'rsatadiki, bir proteindan ikkinchisiga neytral o'tish barqarorlikni sezilarli darajada
barqaror ushlab turadi. Bu beqarorlashtiruvchi mutatsiyalar reversiya yoki
kompensatsiya yo‘li bilan tanlanadi, barqarorlashtiruvchi mutatsiyalar esa funksiya
uchun zarur bo‘lmagani uchun saqlanmaydi, degan gipotezaga mos keladi. Shunisi
qiziqki, oltita barqarorlashtiruvchi mutatsiyalar birikmasi yovvoyi turga qaraganda
3,3 kkal/mol barqarorroq bo'lgan oqsilga olib keldi. Shunday qilib, bu holda
oqsilning yuqori barqarorlikka erisha olmasligi uchun aprior sabab yo'q.
| 