|
Каламуш жигаридан митохондрияларни ажратиш
|
| bet | 7/10 | | Sana | 28.05.2024 | | Hajmi | 0,66 Mb. | | #255961 |
Bog'liq 2 5363800663870425413Каламуш жигаридан митохондрияларни ажратиш
Каламушларнинг жигаридан митохондриялар дифференциал центрифуга усули ёрдамида [83; 625–635-б.]. ҳамда Алматов К.Т. ва бошқалар [2; 103-б.] томонидан киритилган айрим ўзгаришлар билан ажратилиб олинди.
Декапитация қилинган ҳайвоннинг қорин бўшлиги очилиб, жигар қирқиб олингандан кейин стаканга солинди. Стаканга таркиби 0,25 М сахароза, 10 мМ трис-НСI ва этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) - 2 мМ стаканга солинди (рH 7,4). Ажратиш муҳити аввалдан совутилган 0-10С атрофида бўлиши таъминланди. Стакандаги жигар қайчи билан бир нечта бўлакларга бўлинди ва қондан тозаланди. Жигар бўлакларини бир 45
жойга тўплаб, уларнинг оғирлиги торозида тортилади ва диаметри 1 мм ли микромайдалагичдан босим остида ўтказилди. Микромайдалагичдан ўтган жигар молибден шишадан тайёрланган гомогенизаторга солинди ва устига 1:10 нисбатда (1 г жигар тўқимасига 10 мл) совутилган ажратиш мухитидан қуйилиб, тефлонли пестик билан 50-60 сония давомида гомогенизация қилинди. Гомогенизациянинг муҳим шартларидан бири фойдаланаётган эритмалар ва ашёларнинг ҳарорати 00-40С дан ошмаслиги керак, чунки бу муолажалар лизосомал энзимларни қисман ажралишига ва рН пасайишига олиб келади. Иккала омил ҳам препаратлардаги митохондрияларнинг сифатига таъсир этади. Шунинг учун митохондрия ажратиш бўйича барча операциялар совуқ хонада ва муз билан совутилган идишларда олиб борилди. Гомогенатдан митохондрияни ажратиш учун ЦЛР-6 центрифугадан фойдаланилди. Ҳосил қилинган гомогенат аралаштирилди ва полиэтилендан тайёрланган центрифуга пробиркаларига қуйилди. Центрифугадаги муҳит 0-2°С ни ташкил қилди ва центрифугалаш жараёни 2 босқичда амалга оширилди.
Биринчи босқичда, центрифугалашда минутига 1500 айланиш тезлигида (нисбий марказдан қочувчи тезланиш 600 g) 7-8 минут давом этди. Бу вақтда ҳужайранинг оғир агрегатлари чўкади. Чўкма супернатанти бошқа тоза ҳолдаги пробиркага олинди ва центрифуга роторига жойлаштирилди. Иккинчи босқичда центрифугалаш минутига 6000 айланиш тезлигида (нисбий марказдан қочувчи тезланиш 6000g) 15 минутда амалга оширилди.
Супернатантда эса енгил митохондриялар ва микросомалар қолади. Супернатант тўкиб ташланди ва чўкма устига пипеткада 2-3 мл ажратиш мухити пробирка деворига текизилиб оҳисталик билан қуйилади (чўкмадаги митохондрия чайқалиб кетмаслиги учун) ва аста-секинлик билан қуйилган суюқлик тўкиб ташланди. Бунинг натижасида пробирка деворларида ёпишиб қолган микросома ва енгил митохондриялар, хамда тўқимадаги хар хил энзимлар ювилиб чўкмадаги митохондриялар тозаланди. Ундан кейин, яна пробиркага 1-2 мл ажратиш мухити солиниб аввалдан совутилиб қўйилган шиша таёқча билан чўкмадаги митохондриялар яхшилаб аралаштирилиб бир хил ҳолатга келтирилди. Бунда 1 мл митохондрияда 70-80 мг оқсил бўлишига эришиш керак.
46
|
| |
