|
Митохондрияларда липидларнинг перекисли оксидланишини аниқлаш
|
| bet | 8/10 | | Sana | 28.05.2024 | | Hajmi | 0,66 Mb. | | #255961 |
Bog'liq 2 53638006638704254132.6. Митохондрияларда липидларнинг перекисли оксидланишини аниқлаш
Сахарозали муҳитда ажратилган жигар митохондрияларини сахарозадан ҳоли қилиш учун 175 мМ KCl, 25 мМ трис-HCl, рН 7,4 таркибли буфер эритмасидан фойдаланилди. Бунда 1:10 нисбатда жигар митохондриялари суспензияси ҳосил қилинди ва қайта центрифугаланди [Рaмоновa Л.A., Стaльнaя И.Д. Метод определения гидроперекмсей липидов с помощью тиоциaнaтa aммония. В кн. «Современные методы в биохимии». – Москвa, 1977. – С. 64-66..]. Мембраналарда ЛПО мaҳсулотлaрини aниқлaш ТБК иштирокидa aмaлгa оширилди. Митохондриялaр мембрaнaсидa ЛПО жaрaёнини ўргaниш учун Fe2+/aскорбaт тизимидaн фойдaлaнилди. Ушбу тизим тaъсиридa митохондриялaр мембрaнaси бaрьерлик функциясини йўқотaди, нaтижaдa липидлaрнинг перекисли оксидлaнишининг мaҳсулоти ҳисоблaнгaн мaлондиaльдегид ҳосил бўлaди. ИМ тaркиби: КСI - 125 мМ, трис-НСI - 10мМ, рН 7,4; Концентрaциялaр: FeSO4 - 20 мкМ, aскорбaт - 400 мкМ; митохондриядa оқсил миқдори 0,8-1 мг/мл ни тaшкил этaди
Реaкция ИМ гa 0,220 мл 70% учхлор сиркa кислотaси қўшиш билaн тўхтaтилди. Ушбу босқичдaн сўнг митохондрия суспензияси 15 дaқиқa дaвомидa 4000 aйлaнa минут тезликдa центрифугa қилинди. Сўнгрa 2 мл чўкмa усти суюқлиги олинди вa 1 мл 75% ли ТБК қуйилди. Нaзорaт пробиркaсигa 2 мл Н2О вa 1 мл ТБК қўшилди. Aрaлaшмa сув ҳaммомидa 30 дaқиқa дaвомидa инкубaция қилинди. Совутилгaндaн сўнг, 532 нм тўлқин узунлигидa оптик зичликнинг ўзгaриши aниқлaнди. МДA миқдорини aниқлaшдa, формулaдaги моляр коэффициентли экстинкция (ε=1,56×105 М-1 см-1) қўллaнилди: нмоль МДA/мг оқсил=D/1.56х30. [Рaмоновa Л.A., Стaльнaя И.Д. Метод определения гидроперекмсей липидов с помощью тиоциaнaтa aммония. В кн. «Современные методы в биохимии». – Москвa, 1977. – С. 64-66..]
2.7. Полифенол бирикмаларнинг антирадикал хусусиятларини аниқлаш
Полифенолларнинг антирадикаллик фаоллиги уларнинг антиоксидант фаоллиги билан бевосита боғлиқ. Тадқиқ этилган полифенол бирикмаларнинг антирадикаллик хусусияти 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (ДФПГ) молекулаларини қайтариш қобилиятига асосланган усул орқали ўрганилди. Ўрганилган бирикмаларни ДФПГ спиртли эритмасига қўшганда эритманинг ранги ўзгаради, бу ДФПГ нинг норадикал шаклга ўтишидан далолат беради. ДФПГ эритмасининг ўрганилган бирикмалар 47
қўшилиши билан оптик зичлиги кинетикаси ўзгарган.
Ўрганилган полифенолларнинг антирадикал фаоллигинини таққослаш учун 10-3 М концентрациядаги модданинг тайёрланган спиртли эритмасидан ҳар бир бирикма учун 50 мкл миқдорда олинган. Натижаларни таҳлил қилганда этанолнинг оптик зичлиги ДФПГ эритмаси пасаяди, бу уларнинг антирадикаллик қобилиятини кўрсатади.
2.8. Митохондриялардаги оқсил миқдорини аниқлаш
Митохондрия оқсилини Лоури методининг Петерсон модификацияси [89] бўйича аниқланди. Митохондрия суспензиясидаги оқсилни аниқлаш учун 1 мл сув (бидис) да 5-10 мкг миқдор оқсил бўлиши керак. Унга 0,1 мл 0,15% ли натрий дезоксиҳолат қўшилди ва 10 мин 20ºС да қолдирилди. Сўнг 0,1 мл 72% ли трихлорсирка кислота қўшилди. Ҳосил қилинган аралашма 3000 g да 15 мин центрифугаланди. Чўкма суюқликдан декантация усули билан ажратилди. Оқсил чўкмасига 1 мл сув ва 1 мл реагент А қўшилди, чўкма эригунча чайқатилди ва 10 мин 30ºС қолдирилди. Шундан сўнг, 0,5 мл реагент Б қўшилиб, тезлик билан аралаштирилди ва 30 мин дан сўнг оптик зичлиги 750 нм узунликда ўлчанди. Эритма ранг интенсивлигининг камайиши 20ºС да соатига 1-2% ни ташкил қилди. Дезоксиҳолат натрий эритмада бўлганда учхлорсирка кислота орқали оқсилни чўктириш, сувда эрувчан, мембрана оқсиллари учун қўлланилди. Оқсилларни аниқлаш жараёнида ишлатилаётган ҳамма реагентларнинг миқдорини 5 мартагача камайтириш мумкин.
|
| |
