Virologie sommersemester 2017 Vorbemerkungen Wegen der nur begrenzt verfügbaren Zeit können im Rahmen dieses Praktikums nur einige der in der virologischen Labordiagnostik üblichen Untersuchungsverfahren

Die Polymerasekettenreaktion (PCR) dient der automatisierten Amplifikation von DNA-Fragmenten. Das Prinzip wurde 1983 durch Kary Mullis entwickelt. Hierfür erhielt er 1993 den Nobelpreis für Chemie. Die Vermehrung einer DNA-Matrize erfolgt zyklisch, indem zunächst die doppelsträngige DNA in einzelsträngige DNA bei 94 °C denaturiert wird. Daraufhin können bei niedrigeren Temperaturen (zwischen 50-60 °C) zwei kurze (20-25 Basen) Oligonukleotidprimer mit der Matrize hybridisieren. Anschließend erfolgt bei ca. 72 °C die Elongation der Primer vom 3’OH-Ende her mit Hilfe einer hitzestabilen Polymerase und freier Desoxynukleotide. Dies führt zur Komplementierung der Matrize in doppelsträngige DNA, welche der Ausgangsmatrize exakt gleicht. Bei jedem Durchlauf eines Zyklus verdoppelt sich somit das gewünschte Fragment. In einem so genannten Cycler findet eine automatisierte Wiederholung dieses Vorgangs statt, so dass die Anzahl der amplifizierten DNA exponentiell ansteigt.

Quelle: Wikipedia.org -Enzoklop

Primer (Oligonukleotide) die zur Amplifikation bestimmter Genabschnitte dienen, können anhand der Zielsequenz ausgewählt und mit verschiedenen Programmen (z.B. Oligo Calculator, s.u.) überprüft werden (z.B. Schmelztemperatur, mögliche Haarnadelstrukturen, sowie Selbst- und Heterodimerisierungen sind dabei zu berücksichtigen und zu Vermeiden). Allgemeine Regeln für das Primerdesign sind: eine Länge zwischen 20 und 30 nt, GC-Gehalt 40-60%, Schmelztemperatur zwischen 50 und 60°C. Es sollte zudem überprüft werden, dass der Primer spezifisch ist (z.B. über den Abgleich mit Sequenzen in GenBank oder anderen Datenbanken, über das BLAST Programm (siehe unten).