HINTERGRUNDWISSEN
Hepatitis C Virus:
Es gibt sechs etablierte HCV Genoytpen mit unterschiedlicher geographischer Verteilung (ein siebter wurde vor kurzem beschrieben).
Quelle: Simmonds P, J Gen Virol. 2004.
Für die Behandlung des Hepatitis C Virus ist es sehr wichtig, den HCV Genotypen zu kennen, da verschiedene Genotypen unterschiedliche gut auf die bisherige Standardtherapie mit pegyliertem Interferon und Ribavirin ansprechen und diese Medikamente viele Nebenwirkungen haben können. Deshalb hängt oft auch die Behandlungsdauer vom HCV Genotypen ab.
Methode: Aufreinigung der viralen RNA aus Patientenmaterial
Vor der Durchführung der PCR ist es notwendig, die virale RNA oder DNA aufzureinigen. Das klinische Material würde zum einen die PCR hemmen, zum anderen liegt das virale Genom nicht frei vor, sondern ist von viralen Proteinen geschützt (z.B. dem Kapsid). Zur Aufreinigung können verschiedenste Methoden benutzt werden. Für diesen Kurs erhalten Sie bereits aufgereinigte RNA/DNA, die mit einem kommerziellen Kit (siehe Abbildung) aus der Patientenprobe extrahiert wurde.
Abbildung: Ablauf der RNA/DNA-Extraktion ( modifiziert von www.qiagen.com)
Das Prinzip dieses Extraktionskits wurde bereits 1990 von Boom et al. publiziert (Journal of Clinical Microbiology, 1990). Zuerst wird die Probe mit einem Lyse-Puffer versetzt, der die virale Struktur aufbricht. Hierdurch wird das virale Genom frei zugänglich und die Probe ist nicht mehr infektiös. In diesem Puffer liegen chaotrope Salze in hoher Konzentration vor, in deren Gegenwart die virale RNA/DNA an Silikapartikel gebunden werden kann. Die Silikapartikel liegen in den säulenbasierte Verfahren als Membran in einer Säule vor. Durch die Membran kann die lysierte Probe mittels Zentrifugation gepresst werden, wobei die RNA/DNA an die Membran bindet. Nach mehrfachem Waschen mit Ethanolhaltigen Puffern wird die virale RNA/DNA schließlich von der Silikamembran in der Säule gelöst.
Methode: Polymerasekettenreaktion (PCR)
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