Wichtig: Fassen Sie die Blot-Streifen nur mit der Pinzette (nicht mit den Händen) am oberen Ende an!
Jede Zweiergruppe pipettiert je 1 ml des Detektions-Antikörpers (Ak) so auf ihren Test-Streifen, dass er vollständig mit der Lösung bedeckt ist.
Inkubieren Sie den Versuchsansatz 1 Std. bei Raumtemperatur.
Nach Beendigung der Inkubation entfernen Sie die Antikörper-Lösung mittels Pipette.
Waschen Sie die Teststreifen 5 Minuten durch Zugabe von je 1 ml Waschpuffer (TBS-T) mit einer neuen Pipette. Schwenken Sie die Blot-Schale mehrfach in dieser Zeit. Anschließend wird die Waschlösung mit der gleichen Pipette abpipettiert. Dieser Vorgang muss noch 2 mal mit jeweils einer neuen Pipette wiederholt werden.
Mit einer neuen Pipette geben Sie je 1 ml der Substrat-Lösung (Sub) auf die Teststreifen und inkubieren den Ansatz für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Schwenken Sie die Blot-Schale in dieser Zeit mehrfach alle 2 Minuten. Während der Inkubation sollte mindestens eine dunkle Bande erkennbar werden. Entfernen Sie die Substrat-Lösung durch abpipettieren mit der gleichen Pipette.
Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 1 ml Stopp-Lösung (Stop) mit einer neuen Pipette. Inkubieren Sie die Stopp-Lösung für 10 Minuten. Schwenken Sie die Blot-Schale in dieser Zeit mehrfach alle 2 Minuten.
Entfernen Sie die Stopp-Lösung. Greifen Sie den Teststreifen mit der Pinzette am oberen Ende und lassen Sie ihn in der Blot-Schale abtropfen. Anschließend platzieren Sie den Streifen auf einer Lage Zellstoff.
Auswertung:
Auf jedem Teststreifen sollte am unteren Ende (gegenüber der Markierung) eine Bande sichtbar geworden sein. Dabei handelt es sich um eine Test-Kontrolle, die nicht HCV-spezifisch ist. Wenn diese Bande nicht detektiert wird ist der Test nicht auswertbar und darf nicht diagnostisch verwendet werden.
Bei einigen Studenten wird nur diese Kontrollbande sichtbar sein, d. h. das von ihnen untersuchte Serum enthielt keine HCV-spezifischen Antikörper.
Auf einigen Teststreifen wird nach der Detektion noch eine weitere Bande, oberhalb der Kontroll-Bande, zu erkennen sein, während bei den restlichen HCV-Blots insgesamt 4 Banden sichtbar sein sollten.
Bei den Seren mit nur einer HCV-spezifischen Bande könnte es sich um eine beginnende Antikörper-Reaktion in der akuten Phase der HCV-Infektion handeln. Bei den Proben mit 3 HCV-spezifischen Banden ist die Immunantwort schon ausgeprägter. Hierbei könnte es sich um eine akute, eine chronische oder eine ausgeheilte HCV-Infektion handeln.
Bei dem Nachweis von einer oder mehrerer HCV-spezifischer Banden ein Nukleinsäure-Nachweis (z.B. PCR) durchgeführt werden, um zu ermitteln, ob es sich um eine akute, chronische oder durchgemachte Infektion handelt.
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