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VERSUCH:
Bestimmung von Hepatitis C Virus (HCV)-spezifischen Antikörpern in humanen Seren mittels Western Blot/Immunoblot
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| bet | 15/23 | | Sana | 02.06.2021 | | Hajmi | 2,1 Mb. | | #14718 |
VERSUCH:
Bestimmung von Hepatitis C Virus (HCV)-spezifischen Antikörpern in humanen Seren mittels Western Blot/Immunoblot.
Bei der Hepatitis C Virus Infektion unterscheidet man zwischen der akuten und der chronischen Infektion. Die akute Phase, also das Stadium kurz nach der Infektion, verläuft in den meisten Fällen asymptomatisch. In weniger als 25% der Patienten tritt ein Ikterus während der akuten HCV Infektion auf. In ca. 20% aller Betroffenen heilt die HCV Infektion nach der akuten Phase aus, die verbleibenden 80% entwickeln eine chronische Infektion, d.h. sie bleiben lebenslang HCV-RNA positiv.
Bei Verdacht auf eine Infektion mit dem Hepatitis C Virus gibt es verschiedene Möglichkeiten die Infektion nachzuweisen. Für das Screening führt man den Nachweis HCV-spezifischer Antikörper durch. Dies erfolgt mittels ELISA. Allerdings gibt es bei diesem Verfahren nur die Information, ob das getestete Patienten-Serum im HCV-ELISA reagierte oder nicht. Etwas differenzierter ist der HCV-Blot. Bei diesem Verfahren kann man zusätzlich sehen gegen welche HCV-Proteine Antikörper nachweisbar sind. Der gleichzeitige Nachweis mehrerer verschiedener HCV-spezifischer Antikörper im HCV-Immunoblot schließt eine unspezifische Reaktion oder eine Kreuzreaktion weitestgehend aus.
Am heutigen Kurstag sollen vorbereitete Immunoblot-Streifen (ein Streifen pro 2 Studenten) auf das Vorhandensein verschiedener HCV-spezifischer Antikörper getestet werden:
Um das Risiko einer HCV-Infektion der Studenten durch die Serum-Proben auszuschalten wurden einige Schritte des Immunoblots vorher im diagnostischen Labor des Institutes für Virologie durchgeführt.
Die potentiell infektiösen Seren wurden vor ihrer Verwendung inaktiviert, so dass keine Infektionsgefahr mehr besteht!
Bei dem ausgeteilten Immunoblot-Streifen handelt es sich um eine Nylonmembran, auf welche mehrere rekombinante HCV-spezifische Antigene getrennt voneinander aufgetragen wurden. Die HCV-Proteine binden unspezifisch an die Nylonmembran.
Anschließend wurde die Membran mit einem Blocking Puffer behandelt. Dieser Puffer enthält Substanzen, die alle noch freien Stellen für eine unspezifische Bindung von Proteinen an die Membran besetzen. Das Besetzen aller Protein-Bindungsstellen ist wichtig, da ansonsten Proteine aus dem zu testenden Serum (u. a. Antikörper) unspezifisch an die Nylonmembran binden würden. Der Blot-Streifen ist nach dem Blocken vollständig mit Blocking-Substanz überzogen, lediglich unterbrochen von den vorher in regelmäßigen Abständen aufgetragenen HCV-Antigenen. In diesem Stadium erscheint die Nylon-Membran immer noch durchgehend weiß.
Im diagnostischen Labor des Institutes für Virologie wurden die Immunoblot-Streifen mit in Puffer verdünnten humanen Seren für 16 Stunden inkubiert.
Nach der Inkubation wurden die Seren abpipettiert und die Blot-Streifen 2 mal für je 10 Minuten mit einem Puffer (TBS-T; Tris buffered saline- Tween 20) gewaschen und anschließend getrocknet. In diesem Zustand befinden sich die von Ihnen zu untersuchenden HCV-Blot-Streifen. Die Oberseite der Teststreifen ist markiert, dies dient gleichzeitig als Orientierung für die spätere Auswertung des HCV-Immunoblots.
Versuchsablauf:
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Bosh sahifa
Aloqalar
Bosh sahifa
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Bestimmung von Hepatitis C Virus (HCV)-spezifischen Antikörpern in humanen Seren mittels Western Blot/Immunoblot
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