| Pipettierschema:
Zur Vereinfachung werden Ihnen die unten stehenden einzelnen Reagenzien in zwei fertigen Sub Mastermixen gegeben. Diese werden auf Eis ausgegeben, um die Reverse Transkriptase Reaktion zu verlangsamen (dieses Enzym kann nicht reversibel blockiert werden).
Die Zusammensetzung eines Reaktionsansatzes ist wie folgt:
50 µl Ansatz:
Mix A
(Gesamt: 20µL)
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PCR-Wasser
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16 µl
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Sense Primer: DM101*1 [10 µM]
|
1 µl
|
Antisense Primer: DM100*2 [10 µM]
|
1 µl
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Enzym Mix aus Reverser Transkriptase und DNA Polymerase
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2 µl
|
Mix B
(Gesamt: 25µL)
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2x Reaktionspuffer (enthält bereits 0.4 mM von
jedem der vier dNTPs und 1.6 mM MgSO4)
|
25 µl
|
|
Template: HCV RNA aus Patienten Plasma
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5 µl
|
|
Gesamt:
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50 µl
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*1 DM101 5’-TTCTCRTATGAYACCCGCTGYTTTGA-3’
*2 DM100 5’-TACCTVGTCATAGCCTCCGTGAA-3’
(Primersequenz nach Murphy et. al. JCM 2007)
Anleitung:
Legen Sie 5 µL aufgereinigte RNA auf den Boden des 0.2 mL PCR-tube vor.
Pipettieren Sie 20 µL von Mix A
Pipettieren Sie 25 µL von Mix B
Verschließen Sie das PCR tube
Schreiben Sie Ihre Platznummer aus das Tube (bei mehreren Studenten pro Team stets die jeweils niedrigste)
Geben Sie das Tube dem Kursassistenten.
Die PCR-Reaktion wird vom Kurspersonal in einem Thermocycler durchgeführt. Für die Amplifikationen wird das folgende Temperaturprotokoll gewählt:
PCR-Protokoll:
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|
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Zeit [s]
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Temp. [°C]
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Zyklen
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Reverse Transkription
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1800
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50
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1
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Initiale Denaturierung
(hier wird die RT inaktiviert und die Polymerase aktiviert, die bisher durch einen Antikörper blockiert war)
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180
|
95
|
1
|
Denaturierung
|
15
|
95
|
|
Annealing
|
20
|
55
|
45x
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Elongation
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40
|
68
|
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Finale Elongation
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120
|
68
|
1
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Kühlung
|
Pause
|
4
|
1
|
Nach der PCR wird von Ihnen eine Agarosegelelektrophorese durchgeführt, um zu prüfen, ob das gewünschte Amplifikat gebildet wurde.
Methode: Agarose-Gelelektrophorese
HINTERGUNDWISSEN
Bei dieser molekularbiologischen Standardmethode werden DNA-Fragmente in einem elektrischen Feld der Größe nach aufgetrennt. Bedingung für die Wanderung der aufzutrennenden DNA zur Anode im Gleichstromfeld ist deren negative Gesamtladung, die durch gezielte Pufferbedingungen erhalten wird. Es besteht über einen weiten Größenbereich ein linearer Zusammenhang zwischen dem dekadischen Logarithmus des Molekulargewichtes einzelsträngiger, linearer DNA und ihrer Laufdistanz im Gel. Die Auftrennung ist u.a. beeinflussbar durch Pufferbedingungen, Agarosekonzentration und angelegter Feldstärke. Diese Methode wird unter anderem angewendet, um die erfolgreiche Amplifizierung von DNA in der PCR zu kontrollieren. Gemäß der Größe der aufgetragenen Fragmente wird hier ein 1,5-prozentiges Gel (100 bp Fragmentgröße) verwendet. Die Agarose wird in entsprechender Menge 1 x TBE-Puffer aufgekocht. Anschließend kann das Gel in eine entsprechende Form gegossen werden und aushärten. Die Probenbeladung erfolgt, indem der Probe final Gelbeladungspuffer (6x konzentriert) zugesetzt wird. Dieser hat die Aufgabe, die DNA in die Probentasche einsinken zu lassen. Als DNA-interkalierende Substanz ist dem Ladepuffer SYBR Green zugesetzt, wodurch die DNA unter UV-Anregung sichtbar gemacht wird.
VERSUCH
Agarose-Gelelektrophorese der PCR Produkte der One-Step RT-PCR
Gel:
100 ml TBE 1x
1,5 g / 1 % Roth Broad-Range Agarose (= 1,5%)
Erhitzen in der Mikrowelle (ACHTUNG: SIEDEVERZUG MÖGLICH! NICHT DAS GEFÄSS MIT DER KOCHENDEN AGAROSE IN RICHTUNG DES EIGENEN KÖRPERS HALTEN! NICHT VON OBEN INS GEFÄSS SEHEN!)
10 µl PCR-Produkt + 2 µl 6x Loading Puffer; 5 µl 100 bp Ladder
250 V, 30 min
Anschließend wird Ihr Gel unter UV Licht vom Kurspersonal fotografiert.
Unten sehen Sie ein Beispiel Gelbild aus dem Labor. Ihr eigenes Bild kann sich je nach Fragmentgröße von diesem Beispiel in der Höhe der DNA Bande unterscheiden. Flankierend zu den Proben tragen Sie einen Marker (“DNA Ladder“) auf, der Ihnen erlaubt, die Größe der DNA Bande einzuordnen.
Methode: Sequenzierung
Die Sequenzierung der DNA erfolgt nach der Sanger-Kettenabbruchsynthese. Bei diesem Verfahren wird analog zur PCR der zu sequenzierende DNA-Einzelstrang nach Bindung eines spezifischen Primers durch eine Polymerase verlängert. Neben Desoxynukleotiden (dNTP) werden der Reaktion jedoch auch Didesoxynukleotide (ddNTP) beigefügt, welche keine 3’OH-Gruppe besitzen und nach deren Einbau die Synthese abbricht. In der Folge entstehen DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge, die durch hochauflösende Gelelektrophorese aufgetrennt werden können. Anhand des Zeitpunktes, zu dem das gebildete Produkt mit einem fluoreszenzmarkierten ddNTP detektiert wird, lässt sich die Sequenz schlussfolgern. Mit Hilfe einer unterschiedlichen Fluoreszenzmarkierung der vier ddNTPs lässt sich das Verfahren auf die Verwendung eines einzigen Ansatzes reduzieren.
Es kann z.B. das ABI PRISM® Big Dye® Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit verwendet werden, welches alle benötigten Komponenten wie Puffer, Polymerase, dNTPs und ddNTPs als gebrauchsfertigen Reaktions-Mix (Big Dye®) enthält. Ein Beispiel für die genaue Zusammensetzung eines Sequenzieransatzes ist der Tabelle zu entnehmen.
Reaktionsansatz Sequenzierung
Nach der Reaktion werden die Ansätze zunächst durch Gelfiltration (Sephadex) aufgereinigt und anschließend in einem Kapillarelektrophoresesequenzierautomaten aufgetrennt.
Sequenzierautomat ABI 3130
Methode: In-silico Sequenzanalyse
Die NS5b Sequenz des HC-Virus aus der Patientenprobe kann nun mit Vergleichssequenzen aus GenBank (siehe oben) abgeglichen und so der Genotyp bestimmt werden. Es ist mit dem gleichen Verfahren auch möglich, einzelne Nukleinsäureaustausche (Mutationen) zu überprüfen, die z.B. eine Resistenz gegen antivirale Medikamente bewirken können.
Die Sequenzanalyse erfolgt prinzipiell über zwei Wege:
1) Das Anfertigen sogenannter Alignments, in denen die erhaltene Sequenz an Sequenzen bekannter Referenzviren ausgerichtet wird und die Erstellung eines phylogenetischen Baums, der die Verwandschaftsverhältnisse der von Ihnen bestimmten Sequenz graphisch darstellt.
2) Der Abgleich der erhaltenen Sequenz mit den öffentlichen Datenbanken (GenBank), ein sogenannter Blast. Aufgrund mangelndem Internetzugang an Ihrem Arbeitsplatz wird dies nur vom Kursleiter durchgeführt und gemeinsam besprochen. Hier können neben der Bestimmung des viralen Genotyps auch Resistenzmutationen festgestellt werden.
M
Nach klicken von "Subtype" erfolgt eine farbkodierte graphische Darstellung des im BLAST (also dem Abgleich mit allen hier veröffentlichten Sequenzen) am nächsten verwandten Virus:
Methode: HIV-Resistenztypisierung (vom Kursleiter durchgeführt)
Auch hierfür gibt es eine Reihe verfügbarer web-basierter Anwendungen, z.B. Geno2Pheno oder die hier durchgeführte Anwendung der Stanford University.
Nach Aufrufen der Seite unter http://sierra2.stanford.edu/sierra/servlet/JSierra?action=sequenceInput
kann die ermittelte Sequenz eingegeben oder hochgeladen werden:
Durch Klicken von "Analyze" weiter unten auf der Seite erfolgt zunächst eine Subtypsierung und eine Qualitätskontrolle auf unübliche Aminosäuren, Stop Codons, Leserahmenverschiebungen und andere Anzeichen für eine unsaubere Sequenz:
und eine Bestimmung der vorliegenden Mutationen, wobei rund um die Position im kodierten Protein Buchstaben den resistenzvermittelnden Aminosäureaustausch kodieren (z.B. M184V, also Methionin an Position 184 zu Valin durch eine einzelne Punktmutation, die zu Resistenz des Virus gegen den NRTI Lamivudin führt):
Beispiel: HIV Resistenz gegen Lamivudin
Diesem Patienten würde also die Gabe von Nukleosidischen Reverse-Transkriptase Inhibitoren (NRTI) nicht nur nichts nützen, sondern neben den Nebenwirkungen der Medikamente die Progression zu AIDS gestatten.
Methode: Real time PCR
HINTERGRUNDINFORMATION
Die Real-time PCR ist eine Modifikation der “normalen” PCR mit einer wesentlichen Änderung: Es werden außer den beiden Primern noch farbmarkierte Sonden hinzugegeben. Diese Sonden sind mit 25-30 Basen etwas länger als die meisten Primer und hybridisieren deshalb bei höheren Temperaturen an das Template als die Primer. Wenn also die eigentliche PCR Reaktion startet, indem der Primer an das Template hybridisiert und sofort von der Polymerase in 3’-Richtung verlängert wird (5’-3’ Polymerase Aktivität des Enzyms), liegt die Sonde bereits am Template. Nun macht man sich eine weitere Aktivität des eingesetzten Enzyms zunutze, nämlich die 5’-3’-Exonuklease Aktivität. Hiermit kann das Enzym, wenn es beim Verlängern des zum Template komplementären DNA-Stranges auf die Sonde trifft, diese verdängen und zerschneiden. Auf der Sonde liegt am 5’-Ende ein Fluoreszenz Farbstoff (der Reporter) vor. Am anderen Ende (3’-) hingegen befindet sich ein Molekül, dass die Fluoreszenz des Reporters aufnimmt, so dass keine Emission im Gerät gemessen werden kann (der Quencher). Wenn nun die Polymerase die Sonde zerschneidet, können Reporter und Quencher sich durch Diffusion räumlich voneinander entfernen. Die Fluoreszenz des Reporters kann schließlich im Gerät gemessen werden.
Abbildung: Prinzip der real-time PCR
(appliedbiosystems.com und abbottmolecular.com)
Je mehr DNA im Laufe der PCR entsteht, desto mehr Sonde kann hybridisieren und von der Polymerase zerschnitten werden. So entstehen messbare Kinetiken, die quantitative Rückschlüsse auf die Menge der anfangs vorliegenden viralen RNA oder DNA zulassen.
Oft benutzt man Verdünnungen von Material, dessen Konzentration bekannt ist als Standards, mit deren Hilfe die Quantifizierung der Probe sehr genau möglich ist.
Verdünnung von Material bekannter Konzentration: Standardkurve (www.virology-bonn.de)
Da verschiedene Sonden in einer Reaktion benutzt werden können, ist die gleichzeitige Detektion mehrerer Ziele (=z.B. Viren) durch Farbmoleküle verschiedner Wellenlänge möglich. Ebenso kann eine interne Reaktionskontrolle mitgeführt werden, die stets positiv sein muss, um anzuzeigen, dass die Reaktion nicht inhibiert war oder aus anderen Gründen ausgefallen ist. So können falsch-negative Befunde häufig vermieden werden.
Hier einige Beispiele für häufig benutzte Farbstoffe:
Zur Bedeutung der quantitativen und qualitativen Detektion von HCV
Durch die Real time PCR wird das Risiko von Laborkontaminationen durch alte PCR Produkte deutlich vermindert, weil die Reaktionsgefässe nach der Reaktion nicht mehr geöffnet werden müssen. Somit vermindert sich das Risiko falsch-positiver Befunde. Ein weiterer wesentlicher Vorteil ist die im Vergleich zur konventionellen PCR höhere Sensitivität bei gleichzeitig höherem Probenumsatz.
Besonders beim HCV ist eine molekulare Detektion wichtig, da die Zeit zwischen Infektion und serologisch (z.B. ELISA) detektierbaren Antikörpern gegen das Virus im Patientenblut (Serokonversion) bei diesem Virus besonders lange dauert (bis zu 5 Monate). Man spricht hier auch vom „diagnostischen Fenster“.
Neben der qualitativen Detektion (=Ja/Nein) ist aber auch die quantitative Diagnostik bei HCV und anderen Viren von großer Bedeutung:
als diagnostischer Marker
als prognostischer Marker
zur Therapieüberwachung
zur Einschätzung des Übertragungsrisikos
VERSUCH :
One-Step real-time RT-PCR zum Nachweis und Quantifizierung von HCV-RNA
Durchführung
Die Durchführung der PCR erfolgt als one-step RT-PCR in 25 µL-Ansätzen. Dazu wird zunächst ein Mastermix erstellt, der alle Komponenten enthält (siehe Pipettierschema). Nach dem Vorlegen der aufgereinigten RNA/DNA aus der Patientenprobe wird der Mastermix zu den Ansätzen hinzupipettiert. Die Zusammensetzung eines Reaktionsansatzes ist wie folgt:
Pipettierschema
Zur Vereinfachung werden Ihnen die unten stehenden einzelnen Reagenzien in zwei fertigen Sub Mastermixen gegeben. Diese werden auf Eis ausgegeben, um die Reverse Transcriptase Reaktion zu verlangsamen (dieses Enzym kann nicht reversibel blockiert werden).
50 µl Ansatz:
Mix A
(Gesamt: 10 µL)
|
PCR-Wasser
|
6,5 µl
|
Sense Primer: XT5* [10 µM]
|
1 µl
|
Antisense Primer: HCMgR2* [10 µM]
|
1 µl
|
Sonde HCVMGB2 [10 µM]
|
0,5
|
Enzym Mix aus Reverser Transkriptase und DNA Polymerase
|
1 µl
|
Mix B
(Gesamt: 10 µL)
|
Reaktionspuffer (enthält bereits 0.4 mM von
jedem der vier dNTPs und 1.6 mM MgSO4)
|
9 µl
|
Bovines Serum Albumin (1mg/mL)
|
1 µL
|
|
Template: HCV RNA aus Patienten Plasma
|
5 µl
|
|
Gesamt:
|
25 µl
|
(Primersequenz nach Drexler et. al. PLoS Med. 2009 )
Anleitung:
Vor Ihnen steht eine Glaskapillare in einem speziellen Metallstift. Notieren Sie sich die Nummer Ihres Metallstifts (1-32), da Sie die Glaskapillare nicht beschriften können. Pipettieren Sie oben in die Öffnung der Kapillare 5 µL RNA.
Pipettieren Sie 10 µL von Mix A hinzu.
Pipettieren Sie 10 µL von Mix B hinzu.
Verschließen Sie die Kapillare mit dem hierfür vorgesehenen weißen Stopfen. Drücken Sie hierfür den Stopfen gerade von oben herunter in den Kopf der Kapillare. VORSICHT: NICHT ZU FEST UND NICHT SCHRÄG DRÜCKEN, SONST KANN DIE KAPILLARE ABBRECHEN.
Nehmen Sie den kompletten Metallstift, ohne die Kapillare zu entfernen, und stellen Sie den Stift mit der Kapillare in die Tischzentrifuge.
Zentrifugieren Sie für 30 Sekunden bei 1000 Umdrehungen pro Minute.
Entnehmen Sie ihren Metallstift und gehen Sie mit dem Metallstift nach vorne zum Kurspersonal.
Entfernen Sie unter Anleitung die Glaskapillare aus dem Metallstift und lassen Sie die Kapillare vorsichtig in das Ihrer Nummer entsprechende Loch im hierfür vorgesehenen Karussell fallen.
Drücken Sie die Kapillare vorsichtig von oben an. VORSICHT: BRUCHGEFAHR!
Das Kurspersonal startet nun den Lauf.
Die PCR-Reaktion wird in einem Real time Thermocycler durchgeführt. Für die Amplifikation wird das folgende Temperaturprotokoll gewählt:
PCR-Protokoll:
|
|
|
|
|
Zeit [s]
|
Temp. [°C]
|
Zyklen
|
Reverse Transkription
|
900
|
55
|
1
|
Initiale Denaturierung
(hier wird die RT inaktiviert und die Polymerase aktiviert, die bisher durch einen Antikörper blockiert war)
|
180
|
95
|
1
|
Denaturierung
|
15
|
95
|
45x
|
Annealing und Elongation (in einem Schritt)
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20
|
58
|
Die Fluoreszenz wird in jedem der 45 PCR Zyklen nach dem Annealing- und Elongationsschritt gemessen.
Die Auswertung erfolgt in Echtzeit und wird gemeinsam besprochen.
|
