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Zellkultur: Passagierung einer Affennieren-Zellkultur
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| bet | 6/23 | | Sana | 02.06.2021 | | Hajmi | 2,1 Mb. | | #14718 |
Zellkultur: Passagierung einer Affennieren-Zellkultur
durch Proteasebehandlung
Je zwei benachbarten Kursteilnehmern wird ein Plastik-Gefäß mit adhärent wachsenden Affennierenzellen (Vero-Zelllinie) zur Verfügung gestellt, welche subkultiviert (passagiert, trypsiniert) werden sollen. Die Gefäße sind mit ungeraden Platznummern beschriftet.
- Begutachten Sie Ihre Zellkultur zunächst makroskopisch: die den Zellrasen bedeckende Nährlösung (bestehend aus mehr als 30 Einzelkomponenten: Mineralien, Kohlenhydraten, Vitaminen, Antibiotika, fötalem Kälberserum und Phenolrot als pH-Indikator) sollte möglichst klar und blassrosa getönt sein. Trübung mit oder ohne gleichzeitige Farbabweichung wäre ein Indiz für kontaminierende Mikroorganismen (Pilze, Bakterien). Eine Farbabweichung ins Dunkelrot ist häufig bedingt durch einen zu niedrigen CO2-Partialdruck im Brutschrank und damit verbundener Alkalisierung des Nährmediums. Übersäuerung des Nährmediums mit Gelbfärbung tritt meist bei überalterten Zellkulturen auf. Außerhalb eines CO2-begasten Brutschrankes, u.a. auch im Kurssaal, müssen die Verschlusskappen der Kulturgefäße fest zugeschraubt sein, um einen für die Zellen lebensbedrohlichen pH-Anstieg zu vermeiden. Prüfen Sie mittels eines der Umkehrmikroskope Ihre Zellkultur auf etwa vorhandene Mikroorganismen und hinsichtlich Konfluenz des Monolayers.
- Wenn Ihre Zellkultur alle geforderten Qualitätskriterien erfüllt, gießen Sie das Nährmedium möglichst vollständig in das Abwurfgefäß. Die Befürchtung, hierbei die Zellen zu verlieren ist unbegründet, weil diese sehr fest an der Plastikschicht haften.
- Schütten Sie Waschpuffer, d.h. den gesamten Inhalt eines Glasröhrchens ‚P’, in die Zellkulturflasche, verschließen Sie diese und schwenken Sie die Flüssigkeit auf der Zellschicht (maximal 1 Minute), dann gießen Sie alles in das Abwurfgefäß.
- Schütten Sie Trypsinlösung, d.h. den gesamten Inhalt eines Glasröhrchens ‚T’ in die Kulturflasche, schwenken für einige Sekunden, entfernen diesmal aber nur soviel von der Flüssigkeit, dass der Zellrasen noch gut benetzt bleibt (ca. 1 ml). Innerhalb mehrerer Minuten lösen sich die einzelnen Zellen zunächst von den benachbarten Zellen, runden sich ab, wobei sie anfangs noch Kontakt zur Plastikfläche behalten. Schließlich verlieren sie auch diesen Kontakt und flotieren einzeln und gruppenweise in der trypsinhaltigen Flüssigkeit. Beobachten Sie diesen Vorgang makroskopisch (verstärkte Lichtbrechung des Zellrasens bei Abkugelung der Zellen und Trübung der Trypsinlösung durch flotierende Zellen und Zellgruppen) und mikroskopisch am Umkehrmikroskop.
- Nun fügen Sie den gesamten Inhalt (10 ml) eines Glasröhrchens ‚M’ mit frischem Nährmedium hinzu, resuspendieren durch mehrmaliges leichtes Schwenken die abgelösten Zellen und überführen mittels einer sterilen Pipette
5 ml der Zellsuspension in ein leeres zweites Zellkulturgefäß, welches mit einer geraden Platznummer beschriftet ist. In dem ‚alten’ und in dem ‚neuen’ Kulturgefäß dürften sich jetzt in etwa gleich viele Zellen befinden. Verschließen Sie beide Flaschen fest und legen Sie sie wieder auf Ihren Arbeitsplatz.
- Die Kulturflaschen werden (nach vorheriger Lockerung der Verschlusskappen) im Viruslabor in Brutschränken mit einer definierten CO2-Atmosphäre unter Wasserdampfsättigung inkubiert und Ihnen am folgenden Kurstag wieder übergeben.
Bestimmung des Epstein-Barr-Virus (EBV)-Serostatus mittels des indirekten Immunfluoreszenztestes (IFT): Reaktionsstart durch Inkubation des Probandenserums mit EBV-tragenden Lymphomzellen
Die Erstmanifestation einer Epstein-Barr-Virus-Infektion verläuft bei weitem nicht immer nach dem stereotypen Muster eines Pfeiffer’schen Drüsenfiebers. Andererseits manifestieren sich akute Erkrankungen sowohl infektiöser als auch nicht-infektiöser Ursache nicht selten unter dem klassischen klinischen Bild einer ‚Mononukleose’. Da mit zunehmendem Alter der Anteil der für eine EBV-Primärinfektion noch empfänglichen Individuen abnimmt, muss bei Erwachsenen grundsätzlich jede EBV-Mononukleose-Verdachtsdiagnose äußerst kritisch hinterfragt werden. Beispielsweise ist eine Erstmanifestation der HIV-Infektion klinisch nicht von der ‚typischen’ EBV-Primärinfektion zu unterscheiden.
Die virologische Labordiagnostik der EBV-Infektion basiert im wesentlichen auf drei Parametern: IgG und IgM gegen das sog. virale Capsid-Antigen (VCA) und IgG gegen EBNA1, ein virus-codiertes regulatorisches Protein, welches im Kern von EBV-Genom-tragenden Zellen lokalisiert ist. An den folgenden Kurstagen wird auf die Interpretation von EBV-Testergebnissen näher eingegangen werden, ebenso auf weitere spezielle Untersuchungsmethoden zur Abklärung problematischer Fälle.
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