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EBV-Serostatus: Auswertung des IFT am Fluoreszenzmikroskop
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| bet | 9/23 | | Sana | 02.06.2021 | | Hajmi | 2.1 Mb. | | #14718 |
EBV-Serostatus: Auswertung des IFT am Fluoreszenzmikroskop
Nachweis von Rotavirus-Antigen in einer Stuhlprobe mittels Enzyme Immuno Assay (EIA)
Der Enzyme Immuno Assay (auch Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ‚ELISA’) wird in der virologischen Diagnostik in vielfältigen Variationen zum Nachweis von Antikörpern (auch klassenspezifisch) und in den letzten Jahren auch mehr und mehr zur Erkennung viraler Antigene eingesetzt.
Am Beispiel des mittlerweile recht gut bewährten Rotavirus-Testes soll das Prinzip des EIA verdeutlicht werden.
- Stuhlvorbehandlung (erfolgte bereits im Virus-Labor): eine erbsengroße Menge des Stuhls wurde in 6 ml Puffer aufgeschwemmt, mit ca. 20 Glaskügelchen in einem geschlossenen Gefäß 5 Minuten lang kräftig geschüttelt. Anschließend wurden die groben Stuhlbestandteile mitsamt den Glaskügelchen in ein Zentrifugenröhrchen überführt und abzentrifugiert. Der weitgehend klare Überstand wurde vorsichtig abgenommen und soll von Ihnen in den Virus-Antigen-EIA eingesetzt werden.
- Sie erhalten in einem beschriften Reaktionsgefäß mit der Deckelbeschriftung: Rota, eine kleine Menge einer verdächtigen, bereits vorbehandelten, Stuhlprobe. Außerdem steht für zwei benachbarte Arbeitsplätze folgendes bereit: je ein Reaktionsgefäß mit einer bekannt positiven und negativen Probe, beschriftet mit (+) oder (-), ein Reaktionsgefäß mit einer Lösung von Peroxidase-gekoppelten Anti-Rotavirus-Antikörpern (leicht rötliche Flüssigkeit; Beschriftung: ’’K’’ wie Konjugat), ein Reaktionsgefäß mit farbloser Substrat-Lösung (beschriftet mit ’’S’’), einen Teil einer Mikrotiterplatte mit 4 Vertiefungen (sind beschichtet mit Antikörpern gegen humane Rotaviren), ein Waschgefäß und ein Papierhandtuch.
- Füllen Sie 50 µl der positiven und negativen Kontrollprobe in die jeweils beschrifteten Vertiefungen der Mikrotiterplatte und 50 µl der zu untersuchenden Proben in die übrigen beiden Vertiefungen.
- Dann pipettieren Sie in alle Näpfchen 50 µl der Konjugat-Lösung ’’K’’.
- Nach ca. 45 Minuten entfernen Sie den gesamten Inhalt der Näpfchen mit einer frischen Pipettenspitze und tauchen die Mikrotiterplatte mittels einer Pinzette in das mit Wasser gefüllte Waschgefäß. Nach 5 Minuten schütteln Sie das Wasser aus den Vertiefungen und legen die Mikrotiterplatte umgekehrt auf das Papierhandtuch um das restliche Wasser weitgehend zu entfernen.
- Nun füllen Sie in alle Näpfchen je 50 µl Substratlösung. Nach wenigen Sekunden sollte in der positiven Kontrolle eine deutliche Farbentwicklung erkennbar sein, wohingegen die negative Kontrolle farblos bleiben muss. Entscheiden Sie durch optischen Vergleich mit den Kontroll-Näpfchen, ob die
von Ihnen untersuchte Patientenstuhlprobe Rotaviren enthalten könnte. Protokollieren Sie Ihr Ergebnis.
Weitere Anwendungen des EIA in diversen Varianten in der virologischen Diagnostik: Zum Erreger-Nachweis eignet sich der EIA, wenn in der Untersuchungsprobe mit hohen Virus-Konzentrationen zu rechnen ist. Routinemäßig wird am hiesigen Institut der Antigen-EIA außerdem noch eingesetzt bei: Adenoviren; Astroviren; Hepatitis B Virus (HBV): ‚Surface’ Antigen (HBsAg) und ‚Excreted’ Antigen (HBeAg); Humanes Immundefizienz-Virus (HIV): Capsid-Protein p24; Influenza-Viren; Parainfluenza-Viren; Respiratory Syncytial Virus (RSV).
Sehr viel zahlreichere Anwendungsmöglichkeiten des EIA in der virologischen Diagnostik gibt es beim Nachweis von Antikörpern gegen Viren. In der hiesigen Virus-Diagnostik werden z.Z. routinemäßig Antikörper (meist getrennt nach Immunglobulin-Klassen) gegen die folgenden Viren bzw. Virus-Proteine durchgeführt: Cytomegalie-Virus (CMV); EBV (Nukleäres Antigen EBNA); Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus (FSME); Herpes simplex Viren (HSV); Hepatitis A Virus (HAV); HBV: Surface Antigen (Anti-HBs), Core Antigen (Anti-HBc), Excreted Antigen (Anti-HBe); Hepatitis C Virus (HCV); Hepatitis D Virus (HDV); Hepatitis E Virus (HEV); HIV (kombinierter Antikörper- und Antigen-Test); Masern-Virus; Mumps-Virus; Parvovirus B19; Röteln-Virus; und Varicella Zoster Virus (VZV).
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