| Eslatma: Mikroskop nozik optik asbob bo’lganligi uchun sababsiz uning vintlarini bo’rash, revolverni aylantirib, obyektivlarni o’zgartirish yoki uni revolverdan ajratib olish, ko’zguni o’rnidan sug’urib olish, diafragmani dastagini u yo-bu yoqqa harakatlantirish kabilar qat’iyan man etiladi, chunki bunday nojuya harakatlar mikroskopni yaroqsiz bo’lishini tezlashtiradi
Umumiy gitologiyadan laboratoriya va amaliy mashg’ulotlarni o’tishda mikroskop hamda boshqa turdagi optik asboblardan tashqari turli-tuman jihozlar, bint, turli kimyoviy moddalar, har xil bo’yoqlar, mum, plastilin, tomizg’ichlar, probirkalar va ularning tiqin (probka)lari kabilar shular jumlasidandir.
Gistologik preparatlarni tayyorlash texnikasi
Organizm va organlarning mikroskopnk tuzilishni, ulardan gistologik preporatlar tayyorlab o’rganish mumkin. Preparat tayyorlash texnikasi bir necha bosqichdan iborat: 1) materialni olish; 2) fiksasiya kilish; 3) yuvish; 4) suvsizlantirish-zichlantirish; 5) quyish; 6) kesmalar tayyorlash; 7) bo’yash; 8) kesmalarni suvsizlantirish; 9) yoritish; 10) yakunlash.
1.Materialni olish. Gistologik preporat tayyorlashda material olish asosiy bosqichlardan biri hisoblanadi. Material olishning bir necha usullari bor: a) eksperimental hayvonlar (it, mushuk, quyon, kalamush, sichqon va h.k. ) o’ldirib yoki operasiya qilib olish; b) qolgan hayvonlardan olish. Birinchi usul bilan olinganida to’qimalarda deyarli o’zgarishlar bo’lmaydi, demak, preparatda to’qimaning normal holatdagi mikroskopik tuzilishini ko’zimiz bilan ko’rishimiz mumkin. Ikkinchi usulda esa to’qimalarning o’zgarashi hayvon o’lgandan so’ng qancha vaqt o’tganligiga bog’liq.Vaqt qancha ko’p o’tsa, to’qimalarning tarkibi shuncha ko’p mikroskopik o’zgarishlarga uchraydi, binobarin bu o’rganishni qiyinlashtiradi. Shuning uchun, ayniqsa yozgi amaliyot vaqtlarida, kurs ishlari yoki malakaviy bitiruv ishlari uchun yig’iladigan obyetlarga katta ahamiyat berish lozim bo’ladi. Ekspedisiya paytlarida hamma vaqt fiksatorda eritmalarni olib yurish va uchragan hayvonlardan olingan materiallarni shu zahoti fiksatorlarga solib qo’yish kerak.
2.Fiksasiya qilish. Gistologik preparat tayyorlash uchun olingan material tezda fiksatorga solinmasa, u xolda preparatlarda morfologik o’zgarishi bo’lishi mumkin. Fiksasiya qilishdan asosiy maqsad, to’qimalarda bo’ladigan o’zgarishlarni to’xtatib qo’yishdir. Buning uchun quyidagilarga ahamiyat berish lozim: a) fiksator eritma to’qima oralig’iga tez kiradigan bo’lsin; b) to’qima o’zining tabiiy hayotiy tuzilishini o’zgartirmasin. Organizmdagi organ va to’qimalarning zichligi har xil bo’lganligi sababli fiksatorlar ham har xil qilib olingan. To’qimalardan fiksasiya jarayoni yaxshi ketsin uchun esa quyidagilarga ahamiyat berish lozim: a) olinadigan bo’lakchalarning bo’yi 10-15 mm, qalinligi 3-4 mm kelishi; b) fiksator miqdori yetarli bo’lishi (har bir bo’lakcha uchun uning hajmidam 20 marta ko’proq fiksator bo’lishi lozim); v) bo’lakchalar fiksatorda erkin holda joylashishi kerak. Agar bo’lakchalar soni ko’p bo’lsa, shunga muvofiq ravishda fiksatorning miqdori ham ko’p bo’ladi; g) fiksasiya qilish muddati kamayib yoki oshib ketmasligi lozim. Bordi-yu kamayib ketsa, u holda to’qima yaxshi qotmasligi, yoki uzoq turib qolsa haddan tashqari qotib mikroskopik tuzilishini o’zgartirishi mumkin. Dala amaliyotlarida fiksatorlardan ayrimlarini uzoq muddatga doir ishlatish mumkin. 10 foizli formalin eritmasida yoki Buen suyuqlig’ida bo’lakchalarni bir necha sutkalab saqlash mumkin. Lekin bundan ham ko’proq saqlashga to’g’ri kelsa, fiksatorlarni yangilab turishga to’g’ri keladi. Odatda fiksatorlarni tanlashda mo’ljallangan ishga va qaysi bo’yoqlar bilan bo’yashga qaraladi. Ayrim fiksatorlar ko’pgina morfologik labolatoriyalarda doim qo’llanib yaxshi natijalar beryapti. Bularga quydagilar kiradi.
1. Etil spirti. Fiksator sifatida suvsizlantirilgan spirt yoki 96o li spirt ishlatiladi. Qilinadigan ishlarning maqsadiga qarab spirt konsentrasiyasi o’zgartirilishi mumkin. Masalan to’qima tarkibidagi fermentlarni aniqlash uchun 80o bo’lishi kerak va h.k. Etil spirtning afzalligi shundaki, fikzatiya tez boradi, to’qimalar suvini tez qochirib, oqsilni tez ivitadi. 96o li spirt to’qima ichiga sekin so’rilib, 100o li spirtga nisbatan yaxshi qotib beradi. Spirtli fiksatorga solingan to’qimalar ustiga ko’pgina gistoximiyaviy ishlarni bajarish mumkin. Fiksasiya muddati obyektlarning qalinligiga qarab bir necha minutdan bir necha soatgacha cho’zilishi mumkin. Shuni aytib o’tish kerakki , spirtli fiksator to’qimalarni haddan tashqari burishtirib, qotirib yuboradi. Shuning uchun fiksator sifatida toza spirt kam qo’llaniladi.
2. Formalin boshqa fiksatorlarga nisbatan ko’p qo’llaniladigan eritma. Uning ustunligi shundak, to’qima va organlarga yaxshi singdirib, ularni yetarli darajada qotirib beradi. Bo’lakchalarni uzoq saqlash mumkin. Shu jixatdan uni ayniqsa yozgi amaliyot vaqtlarda ishlatsa ma’qul bo’ladi. Laboratoriya va dala amaliyotida, odatda, 10-15 foizli formalin eritmasi ishlatiladi. Buning uchun 100 foizli formalindan 10 ml olib 90 ml suvga solib aralashtirilsa (distillangan suv ishlatilmasligi kerak) 10 prosentli formalin eritmasi hosil bo’ladi. Laboratoriya sharoitida bo’lakchalarni fiksasiya qilish uchun ularni 10 prosentli formalinda 24 soat saqlash kerak. Bu o’rinda shuni aytib o’tish kerakki, ayrim gistoximiyaviy strukturalarni ko’rish uchun bu eritma foydalanilmaydi .Chunki formalinda ular o’z strukturulari va sifatlarini yo’qotishi mumkin. Gistoximiyaviy tekshirishlar uchun boshqa fiksatordan foydalaniladi.
3. Buen suyuqligi. Buen suyuqligi ham labolatoriya hamda dala amaliyotlarida qullansa bo’ladigan yaxshi fiksator hisoblanadi. To’qima bo’lakchalari va hayvon embrionlarini qoniqarli darajada qotirib beradi. Buen suyuqligi qo’yidagi eritmalardan tayyorlanadi.
Pikrin kislotasining to’yingan eritmasi - 75 ml
Formalin - 25 ml
Muz sirka kislotasi - 5 ml
Fiksator, odatda ish boshlashdan oldin tayorlanadi. Pikrin kislota suvda tez erimaydi, shuning uchun to’yingan pikrin kislota eritmasi oldindan tayyor bo’lishi kerak. Buning uchun idishga 25-30 g kristal holidagi pikrin kislota solinib, ustiga 1 litr qaynoq distillangan suv quyiladi. Eritma uzoq vaqtgacha buzilmaydi. Kislotaning erimagan qismi idishning ostiga cho’kib turishi kerak. Tayyorlangan fiksatorga solingan materiallarni 24 soat va undan ham uzoqroq (bir necha sutkagacha) ushlab turish mumkin. So’ng ikki-uch marta 70-80o li spirtga solib tarkibidagi pikrin kislota yuviladi va suvzlantiriladi, so’ng parafinda qotiriladi.
4. Karnua fiksatori. Gistologiya va gistoximiyaviy usullar uchun qo’llash mumkin. Fiksatorni bevosita eksperimentlardan oldin tayyorlash kerak. Tarkibida : 100o li spirt – 10 ml; xloroform – 6 ml; muz sirka kislotasi – 2 ml . Bo’lakchalarning qalinligi 5 mm dan oshmasligi kerak. Bo’lakchalarning soni ko’p bo’lsa, shunga qarab fiksatorning miqdori ham qo’paytiriladi. Fiksatorga solingan bo’lakchalarning qalinligiga qarab esa xolodilnikda 1,5-2 soatga ushlab turiladi. Agar fiksator 1 soatdan so’ng almashtirilsa, to’qima yana ham yaxshi qotadi va tozalanadi. Bo’lakchalar fiksatorda qotirilgandan so’ng shu zahoti 100o li spirtga solinib qo’yiladi, spirtda bir necha soat ushlab turish mumkin. Karnua fiksatorida bo’lakchalarni uzoq vaqt ushlab bo’lmaydi. Chunki to’qimalar haddan tashqari qotib ketib o’zinig mikroskopik tuzilishini o’zgartirib yuborishi mumkin.
Yuqorida biz bir necha fiksatorlarning tuzilishi va qo’llanishi haqida fikr bayon etdik. Lekin talabalarning kurs yoki bitiruv malakaviy ishlarida oldinga qo’yilgan maqsadga qarab unda boshqa fiksatorlardan ham foydalanishlari mumkin. Adabiyotda fiksatorlarning soni ko’p bo’lib, ular gistologik va gistoximiyaviy ishlarda qo’llaniladi.
3. Yuvish. Materialni fiksatordan so’ng yaxshilab yuviladi. Yuvishdan asosiy maqsad to’qima fiksatorni yuklari va boshqa moddalardan tozalashdir. Buning uchun to’qima fiksatordan olinib, oqib turgan suvda 20-48 soat mobaynida yuviladi. Yuvish jarayoni bo’lakchalar qanday fiksatorlardan o’tkazilganligiga bog’liq. Shunday ayrim fiksatorlar ham borki, ulardan so’ng to’qima yuvilmasdan keyingi bosqichga o’tishi mumkin.
4.Suvsizlantirish-zichlashtirish. Yuvilgan to’qima yaxshilab suvsizlantirilishi lozim. Suvsizlantirish qanchalik yaxshi borsa, materialning keyingi ishlov bosqichlari shunchalik yaxshi o’tadi va maqsadga muofiq, preparatlar olinadi. Suvsizlantirish uchun gradusi oshib boradigan spirtlardan o’tkaziladi, ya’ni to’qima birin-ketin 50o, 60o, 70o, 80o, 96ova 100o li spitlardan o’tkaziladi. Kerakli gradusli spirtlarni olish uchun esa quyidagi jadvaldan foydalanish mumkin (1-jadval).
1-jadval
-
100 ml
spirt olish uchun
| Suyuqliklardan necha millilitr olish kerak |
96° li spirt
|
suv
|
90° li spirt
|
suv
|
80° li spirt
|
suv
|
70° li spirt
|
suv
|
40° 42 58 44 56 50 50 57 43
45° 47 53 50 50 56 44 64 36
50° 52 48 56 44 63 37 71 29
60° 63 37 67 33 75 25 86 14
70° 73 27 78 22 88 12 - -
80° 83 17 89 11 - - - -
90° 94 6 - - - - - -
5. Quyish. Gistologik preparatlar tayyorlashda to’qimalarni parafin yoki selloidinga quyish ham asosiy bosqichlardan biri hisoblanadi.Yaxshi quyilmagan preparatlar, yomon kesiladi va bo’yaladi. Quyish materiallari sifatida parafin, selloiddan va boshqalardan foydalanish mumkin. Parafinga quyish laboratoriyalarda keng tarqalgan. Bu to’qimalarga bir tekisda yaxshi singib tez, ya’ni 1-2 kunda preparat tayorlash imkonini beradi. Sitologiya, gistologiya va embriologiyadan preparatlar tayyorlash maqsadlarida undan foydalanish mumkin. Parafinnig asosiy kamchiligi shundan iboratki, u ayrim to’imalarni haddan tashqari burishtirib yuboradiyu. Shuning uchun tarkibida suvi ko’p yumshoq to’qimalardan preparat tayyorlashda boshqa quyish moddalaridan foydalanish lozim.
6. Kesish. To’qimalar parafinda yetarli darajada qotirilgandan so’ng, bo’lakchalar atrofi parafin bilan o’ralgan holda kesib olinadi va kichik yog’ochdan yasalgan kubchalarga o’rnatildi, so’ng parafin bilan qotirib qo’yiladi. Kesish uchun to’qima yopishtirilgan kubik mikrotomni blok tutgichga o’rnatib mahkam siqib qo’yiladi. Kerakli qalinlikda mikrotom pichog’i o’rnatiladi va kesa boshlanadi. Bunda parafin yumshoq bo’lsa, kesmalar burishib qolishi mumkin, u holda to’qima o’rnatilgan blokdagi parafinni biroz sovutish kerak. Buning uchun, muzlatgichdagi tayyor muzlardan foydalanish mumkin. Parafin haddan tashqari qattiq bo’lsa, kesmalar maydalanib ketadi va yirtilib yoki buralib chiqadi. Bunga yo’l qo’ymaslik uchun kesmalarni biriunchi yupqaroq qilib olish va blok yoniga lampani yoqib qo’yish kerak. Ba’zan kesmalar mikrotom pichog’iga yopishib qoladi, bunday hollarda kesmaga bir yoki ikki tomchi suv tomizib nina bilan asta-sekin so’rib olinadi. Yaxshi chiqqan kesmalarni kistochka yoki preparovka ninasi yordamida mikrotom pichog’idan olinadi va asta 40o atrofida ilitilgan suvga solinsa, kesmalar darrov to’g’irlanib, rostlanadi. To’qimadan kerakli miqdorda kesmalar oliganidan so’ng preparat tayyorlashning navbatdagi bosqichiga o’tiladi.
7. Bo’yash. Kesilgan to’qimalarni odatda oldingi qo’yilgan maqsadga qarab har xil bo’yoqlar bilan bo’yaladi . Gistologiyada qullanadigan bo’yoqlar asosan uch gruppaga bo’linadi: asosli, kislotali va neytral bo’yoqlar.
Asosli bo’yoqlar hujayra asosini tashkil etuvchi qismlarini, ya’ni yadroning, uning xromatin moddasini yaxshi bo’yaydi. Shuning uchun bu bo’yoqlarni bazofil (asosni yaxshi bo’yovchi) bo’yoqlar deyiladi. Masalan gematoksin, hujayra yadrosini binafsha rangga bo’yab beradi, shuning uchun yadroni bazofil strukturalar ham deyiladi.
Kislotali bo’yoqlar – kislota yoki kislota tuzlaridan tashkil topgan. Bu bo’yoq bilan bo’yaladigan hujayra va to’qima elementlari oksifil strukturalar deyiladi. Bunga misol qilib praktikada keng qo’llanuvchi eozin bo’yog’ini olish mumkin. Neytral bo’yoqlar suvda eritilgan kislotali bo’yoqlar bilan asosli bo’yoqlar aralashmasidan hosil bo’ladi. Bunga misol qilib sudan 111 buyog’ini qursatish mumkin. Preparatni bo’yash uchun praktikada gematokoilin eozin bo’yog’idan keng qo’llaniladi. Bunda kesma oldin gematoksilinga 5-8 daqiqa solib qo’yiladi, so’ng yaxshilab distillangan suvda yuvib, eozin bilan 1-3 daqiqa bo’yaladi. Bo’yash muddati bo’yoqlarning yetilganligiga bog’liq.
8. Kesmalarni suvsizlantirsh. Kesmalar yaxshilab bo’yalgandan so’ng distillangan suvda bir necha bor yuviladi, so’ng ularni suvsizlantirish kerak. Kesmalar yaxshilab yuvilmasa, yoritish vaqtida ksilol suv bilan aralashmasdan preparat qoniqarli yoritilmaydi. Buning uchun kesmalar gradusi oshib boruvchi –60, 80, 96 va 100o li spirtlardan o’tkaziladi. Har bir spirtda 2-3 minut ushlab turiladi.
9. Yoritish. Preparatlarni yoritish uchun har xil suyuqliklardan foydalaniladi. Suyuqliklar bo’yalgan preparatlarni tiniqlashtiriladi va yorishtiradi. Yoritish uchun karbol-ksilol, karbol-toluol yoki karbol skipidar eritmalari qo’llanadi. Eritmada kesmalar 0,5-1 daqiqadan ko’p saqlanib qo’ylganda karbol-ksilol bilan karbol - toluol kesmasining bo’yog’iga ta’sir qilib qolishi mumkin, shuning uchun preparatga bal’zam tomizishdan oldin, uni 1-2 toza ksilolda ushlab turish kerak.
10. Yakunlash. Yakunlash uchun preparat ksiloldan olib havoda ko’p ushlamasdan ksilol yuqini filtr qog’ozga shimdirib olinib, ustiga bir tomchi bal’zam tomiziladi, so’ng yopqich oyna bilan asta yopiladi. Buning uchun Kanada yoki kedr bal’zamlaridan foydalaniladi.
| 